外泌体miRNA与胃癌关系的研究进展

魏守鑫，贾映东，余思佳

（1. 川北医学院，四川 南充 637100 ；2. 遂宁市中心医院，四川 遂宁 629000）

胃癌是指起源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，其恶性程度很高。近年来胃癌的发病率虽然有所下降，但其发病率在所有恶性肿瘤中仍居第四位，其致死率在所有恶性肿瘤中居第二位。目前，临床上尚未彻底阐明胃癌的发病机制，一般认为此病的发生与患者饮食习惯不良、存在幽门螺杆菌感染、患有慢性萎缩性胃炎及遗传因素等有关。早期胃癌患者通常无明显的症状，少数患者可出现恶心、呕吐、上腹部不适等类似胃炎或胃溃疡的症状。因此，早期胃癌的确诊率较低。多数胃癌患者的病情在得到确诊时已发展至晚期，错过了最佳的治疗时机，其五年的生存率较低。目前，临床上对胃癌患者主要是进行手术和（或）化疗。尽管近年来针对胃癌的手术和化疗已取得长足发展，但胃癌患者的预后仍然很差。针对胃癌患者的基因靶点进行干预，有望成为治疗胃癌的新手段。近年来的研究发现，外泌体miRNA 与胃癌的发生、浸润和转移关系密切[1]。研究外泌体miRNA 与胃癌的关系可能为临床上治疗胃癌找到一条新途径。本文主要是介绍外泌体miRNA 与胃癌关系的研究进展。

1 外泌体的结构和功能

1983 年，外泌体首次于绵羊的网织红细胞中被发现。外泌体是一种由细胞内溶酶体微粒内陷形成的双层盘状囊泡小体，其直径为40 ～150 nm，其内包裹着大量的蛋白质、脂质DNA、miRNA、mRNA、长链非编码RNA 和其他遗传物质。起初人们认为外泌体的形成仅仅只是细胞排泄废物的一种方式，但随后的研究发现，外泌体可在细胞间起到信息传递的作用，参与抗原提呈、免疫调节等，并与老年痴呆、不孕症、病毒感染等多种疾病的发生发展有关。在肿瘤细胞中，外泌体的作用尤为突出，与肿瘤细胞的血管生成、转移、耐药性的出现及免疫抑制等密切相关[2]。人体的所有细胞均可分泌外泌体，但肿瘤细胞分泌外泌体更为活跃。外泌体作为细胞间的信使，可转运miRNA、siRNA、蛋白质等物质，从而可促进肿瘤的发生发展。miRNA 是一类长度为19 ～25 个核苷酸的非编码RNA 分子，其合成过程是：首先由细胞核内的多聚酶转录形成Pri-miRNA，经Drosha-DGCR8 复合物的切割，产生长度约为70 个核苷酸的per-miRNA，per-miRNA 与exportin5、RanGTP 等结合后被运往细胞质，最后由胞质内的Dicer 酶及TRBP 蛋白修饰成成熟的miRNA。miRNA 通过与目标mRNA 的 3’非编码区结合，抑制其蛋白质的合成或直接降解目标mRNA，可对基因的表达产生负性调控作用[3]。miRNA 与目标mRNA的结合不需要完全遵守碱基配对规律，一种miRNA 可调控多种mRNA，一种mRNA 可接受多种miRNA 的调控。迄今为止，人们已发现2500 余种miRNA，有超过30% 的人类基因受到miRNA 的调控，其异常表达与包括胃癌在内多种癌症的发生发展密切相关[4]。

2 外泌体miRNA 与胃癌的关系

2.1 外泌体miRNA 对胃癌的早期影响

2.1.1 外泌体miRNA 与肿瘤细胞增殖的关系 细胞的癌变往往伴随着原癌基因的激活和抑癌基因的失调。外泌体作为细胞间信号传递的信使，在细胞癌变的过程中扮演着双面角色。Shi 等[5]认为，胃癌细胞分泌的外泌体可将miRNA-221 传递至HGC-27 细胞，下调细胞周期素依赖的激酶抑制剂CDKN1B/p27 和CDKN1C/p57、促凋亡因子bmf 和bbc3/PUMA 的表达，以及下调PI3K/AKT 途径抑制剂PTEN、细胞黏附调节因子PtPμ 和金属肽酶抑制剂TIMP3 等多种肿瘤抑制物的表达而促进HGC-27 细胞的增殖。正常细胞分泌的外泌体可抑制肿瘤细胞的增殖，而肿瘤细胞分泌的外泌体可促进肿瘤细胞的增殖。研究发现，健康人胃黏膜上皮细胞分泌的miR-101 在PIM1 的3'UTR 区域具有特定的结合序列，可由外泌体转运靶向PIM1 位点，进而可促进肿瘤细胞的凋亡。Wu 等[6]研究发现，早期胃癌患者血浆中miR-101的水平明显低于健康人。

2.1.2 外泌体miRNA 与肿瘤微环境的关系 肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是指由血管、细胞外基质、成纤维细胞、免疫细胞等构成的一个肿瘤细胞赖以生存和发展的复杂环境。外泌体miRNA 可在一定程度上改变TME，影响肿瘤细胞的生长。血管将营养物质运送到各个细胞内以供细胞的生长。肿瘤细胞的生长方式亦不例外。有研究指出，直径超过1 mm 的恶性肿瘤必须依赖新生毛细血管才能得以生存，因此肿瘤细胞的生长必定伴随着大量新生毛细血管的生成[7]。外泌体可通过携带miRNA 促进肿瘤内新血管的生成。例如，胃癌细胞分泌的外泌体中的miR-135b 可抑制FOXO1 蛋白的释放，进而升高血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血浆中的表达水平，促进肿瘤内新血管的生成[8]。Zhang 等[9]研究发现，M2 巨噬细胞分泌的外泌体中的miR-130b-3p 可作用于染色体7q36.1 上的MLL3 基因，抑制转录因子粒状头样2 的表达，促进胃癌病灶内新血管的生成。此外，外泌体也可直接转运VEGF、长链非编码RNA 和基质金属蛋白酶等，促进肿瘤内新血管的生成。值得一提的是，肿瘤细胞早期增殖的速度较快，可导致TME 缺氧，而缺氧环境可使肿瘤细胞外泌体的分泌增多，从而促进肿瘤内新血管的生成[10]。

2.2 外泌体miRNA 对胃癌侵袭转移的影响

胃癌的转移是其进展的重要过程，也是影响此病患者预后的重要因素。胃癌的主要转移方式包括肿瘤细胞直接浸润、淋巴转移、血行转移及种植转移。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是肿瘤细胞转移的重要组织屏障，肿瘤细胞的侵袭转移往往伴随着ECM 的成分改变、降解等。肿瘤相关成纤维细胞（carcinoma-associated fibroblasts，CAF）是肿瘤细胞基质的重要组成部分，大部分CAF 位于肿瘤与周围间质的交界处或新生血管附近，可通过重塑ECM 的成分促进肿瘤细胞的转移[11]。最新的研究表明，外泌体miRNA 可促进胃癌细胞的转移。CAF 分泌的外泌体可被间皮细胞（mesothelial cells，MC）摄取，而外泌体携带的miR-106a 可抑制Smad7 的表达，导致α- 平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和纤维连接蛋白的水平升高。α-SMA 是细胞骨架蛋白微丝系统的一部分，可为细胞运动和细胞内运输提供动力，促进细胞的迁徙、凋亡、增殖等，并对MC 造成损伤，促进胃癌细胞的转移[12]。Zheng 等[13]将胃癌细胞SGC-7901 与巨噬细胞分泌的外泌体进行共培养后发现，胃癌细胞中miR-223的表达水平显著升高，肿瘤细胞的转移能力显著增强，其机制可能是巨噬细胞通过分泌外泌体传递miR-223，激活PTEN-PI3K/AKT 通路，促进胃癌细胞的转移。Sung 等[14]研究发现，肿瘤细胞外泌体携带的整合素可与ECM 中的纤维连接蛋白结合，提供用于肿瘤细胞黏附和迁移的底物，进而可提高肿瘤细胞的侵袭和转移能力。外泌体也可通过促进肿瘤细胞表面侵入性伪足的形成而降解ECM，促进肿瘤细胞的转移。而侵入性伪足又可作用于CD63 和Rab27a MVBs 位点，反馈性地促进肿瘤细胞分泌外泌体。除此以外，外泌体也可直接通过其自身携带的基质金属蛋白酶、透明质酸降解ECM，促进胃癌细胞的转移。

2.3 外泌体miRNA 在胃癌诊疗中的应用

2.3.1 外泌体miRNA 与肿瘤免疫逃逸的关系 程序性死亡 配 体-1（programmed death ligand-1，PD-L1） 是一种重要的免疫抑制分子，由CD274 基因编码，并由MAPK、EGFR、PI3K-Akt、JAK-STAT 等 多 种 通 路 激活。PD-L1 与其受体蛋白PD-1 结合后可抑制T 淋巴细胞的活化、增殖和细胞因子的分泌，从而抑制T 淋巴细胞的抗肿瘤活性。越来越多的证据表明，包括胃癌细胞、乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞等在内的多种肿瘤细胞均可通过上述方式逃避T 淋巴细胞的清除，PD-1/PD-L1 通路的激活已成为导致肿瘤免疫逃逸的关键机制[15]。肿瘤细胞分泌的外泌体除了可直接转运PD-L、损害CD8+T淋巴细胞的功能而形成肿瘤免疫逃逸外，还可通过转运miRNA 而加剧肿瘤免疫逃逸[16]。Li 等[17]研究发现，胃癌患者体内miR-675-3p 的表达水平较正常人明显升高，通过分析其双荧光素酶报告基因，证实miR-675-3p可与CXXC 型锌指蛋白4 基因结合，通过MAPK 信号通路增强PD-L1 的表达，促进胃癌细胞的免疫逃逸。

2.3.2 外泌体miRNA 可作为新的诊断胃癌的血清肿瘤标志物 目前，临床上主要是采用胃镜检查及胃镜下活检诊断胃癌。早期胃癌患者的病变较小，很难通过胃镜检查发现，且进行胃镜检查会给患者带来一定的不适感，部分患者对检查的依从性较差。现阶段临床上常用的诊断胃癌的血清肿瘤标志物有癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、 甲 胎 蛋（alpha-fetoprotein，AFP）、糖 类 抗 原125（carbohydrate antigen125，CA125）、CA724、CA242、CA199 等。但用上述血清肿瘤标志物诊断胃癌的灵敏度和特异度较低，且这些指标多用于评估胃癌患者术后病情复发的情况。故寻找一种新的血清肿瘤标志物用来诊断胃癌具有重要的意义。国外的研究发现，通过检测血清外泌体miRNA 的表达水平可诊断胃癌。Tang 等[18]利用二代测序及生物信息学分析等方法筛选外泌体中的miR-92b-3p、let-7g-5p、miR-146b-5p 和miR-9-5p，并通过实时荧光定量逆转录- 聚合酶链反应加以验证，通过计算ROC 曲线下面积（area under the curve，AUC）评价诊断的效能，发现用血清外泌体let-7g-5p 检测诊断胃癌的AUC 为0.756、灵敏度为54%、特异度为88%；用血清外泌体miR-92b-3p检测诊断胃癌的AUC 为0.714、灵敏度为54%、特异度为88%；用血清外泌体miR-146b-5p 检测诊断胃癌的AUC 为0.674、灵敏度为46%、特异度为82% ；用血清外泌体miR-9-5p 检测诊断胃癌的AUC 为0.626、灵敏度为50%、特异度为84%；用传统的血清肿瘤标志物CEA 检测诊断胃癌的AUC 为0.520、灵敏度为38%、特异度为70%；用血清外泌体miR-92b-3p、let-7g-5p 联合检测诊断胃癌的AUC 为0.775、灵敏度为64%、特异度为78%。由此可见，外泌体miR-92b-3p、let-7g-5p、miR-146b-5p、miR-9-5p 可作为新的血清肿瘤标志物用来诊断胃癌。

2.3.3 外泌体miRNA 与胃癌药物治疗的关系 化疗是目前临床上治疗晚期胃癌的重要手段，常用的化疗药物有铂类药物和氟尿嘧啶类药物。部分胃癌患者体内的肿瘤细胞易对化疗药物产生耐药性，从而可影响其疗效。研究指出，外泌体miRNA 的表达水平可影响胃癌细胞对化疗药物的耐药性。Zheng 等[19]通过刺激小鼠骨髓获得M2 巨噬细胞，并对M2 巨噬细胞分泌的外泌体进行miRNA 图谱分析，发现外泌体miR-21 的表达水平升高；通过对小鼠进行进一步的体内实验证实，外泌体miR-21 可从M2 巨噬细胞转运至胃癌细胞，并经PTEN-PI3K-AKT 通路使PTEN 表达下调、AKT 活性增强，进而导致胃癌细胞对顺铂出现耐药性。Zhang 等[20]通过分析两组临床病例样本及进行小鼠体外实验发现，外泌体miR-939 不仅能抑制胃癌细胞的生长、转移，还能通过抑制SLC34A2/Raf/MEK/ERK 通路增强胃癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。值得注意的是，外泌体miRNA不仅可通过各自的通路增强或减弱肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，不同的miRNA 作用于同一通路也可能产生截然不同的效果。例如，外泌体miR-206 通过作用于MAPK 信号通路，可抑制p-MAPK3 蛋白的表达，进而降低胃癌细胞对顺铂的耐药性；而外泌体microRNA-135b 通过作用于MAPK 信号通路，可抑制哺乳动物不育系20- 样激酶1 的生成，使肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性[21]。临床实践证实，多种外泌体miRNA 可参与胃癌的微环境形成、增殖、转移、凋亡等过程。抑制可促进肿瘤细胞生长的外泌体miRNA 的表达，或促进对肿瘤具有负向调控作用的外泌体miRNA 的表达，不失为一种治疗胃癌的好方法。Guan 等[22]提出可利用高浓度的质子泵抑制剂抑制外泌体miRNA 的释放，进而抑制CAF 的形成及相关细胞因子的释放，达到治疗胃癌的目的。外泌体miRNA 与胃癌药物治疗的关系详见表1。

表1 外泌体miRNA 与胃癌药物治疗的关系

3 小结及展望

外泌体miRNA 现已被证实能够参与胃癌的发生发展，在胃癌的诊治中可发挥重要的作用。但关于外泌体miRNA促进胃癌发生发展的确切机制尚不清楚，各种miRNA 之间有无拮抗或协同效应也尚未明确。现阶段，进行外泌体miRNA 检测的成本高昂、步骤繁琐，难以在临床上推广应用。因此，需寻找一种高效且成本低的外泌体miRNA 的检测方法。在胃癌进展的不同阶段，研究外泌体miRNA 与胃癌的关系，并有针对性地开发药物制剂以促进或抑制外泌体miRNA 的表达，将成为临床上治疗胃癌的新方法、新途径。