DKK3 与宫颈癌的相关性研究进展

张少芬，王志莲

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，近年研究表明，宫颈癌的发生发展是多基因的遗传学与表观遗传学共同作用的结果。现在越来越多的学者发现肿瘤中表观遗传学的改变，特别是基因的异常甲基化在肿瘤的发生与发展过程中扮演不可或缺的角色，对其进行研究有利于肿瘤的早期发现及在治疗上取得新突破。其中抑癌基因启动子区CpG 岛的异常高甲基化可以引起肿瘤抑制基因沉默表达，与肿瘤发展密切相关[1]。人类DKK3（dickkopf-3）是近年发现的抑癌基因，也是经典Wnt 信号传导通路的重要的细胞外抑制因子。DKK3 在人类恶性肿瘤中普遍下调，是致癌过程中潜在的关键因素。现对DKK3基因的分子生物学特性、在肿瘤中的表达和功能及其与宫颈癌相关性的研究进展进行综述。

1 DKK3 概述

DKK3 基因属于编码分泌性Wnt 拮抗剂的Dickkopf 基因家族（包括DKK1、DKK2、DKK3、DKK4及Soggy），也被命名为“永生化细胞中的减少表达基因”（reduced expression in immortalized cells gene，REIC）。该基因位于人类染色体的11p15.3 位点，这是一个在癌变中常缺失的位点。DKK3 基因包含46 358 个核苷酸，有9 个外显子和2 个启动子，mRNA第198～1 247 碱基对编码产生由350 个氨基酸组成的DKK3 蛋白[2]。

DKK3 是一种分泌糖蛋白，分子质量约为38 ku，是DKK 蛋白家族中的一个特征性成员。DKK3 含有2 个富含半胱氨酸的结构域Cys-1 和Cys-2，其中氨基端富含半胱氨酸的结构域是每个DKK 蛋白特有的，而羧基端半胱氨酸丰富的结构域在家族成员中是保守的，暗示一个保守的功能，这2 个结构域由12 个氨基酸组成的连接区隔开。DKK3 与其他家族成员同样具有几个蛋白酶水解位点，表明其在翻译后发生了修饰。但与DKK1 和DKK2 只有1 个潜在的N-糖基化位点不同，DKK3 具有4 个潜在的N-糖基化位点，且存在特殊结构Soggy（SGY）结构域[3]。

2 DKK3 与肿瘤的关系

2.1 DKK3 的抑癌机制DKK3 属于Dickkopf Wnt信号通路抑制因子家族，该家族成员通过与细胞表面受体或细胞质中伴侣蛋白相互作用而发挥Wnt 信号通路内源性拮抗剂的功能。Wnt 信号是一种进化保守的信号通路，在形态发生和癌变过程中起着重要作用，该信号通路的异常激活在多种恶性肿瘤的发病机制中起着核心作用[4]。DKK3 与DKK1、DKK2和DKK4 不同，不与低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（lowdensity lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）或受体Kremen1 结合[5]，其调控Wnt/β-catenin信号的能力存在争议，可能是通过一种与Wnt 无关的途径参与β-catenin 失活，从而抑制β-catenin 下游的靶基因（例如c-myc、Cyclin D、Axin-2 等）表达。Leonard 等[6]研究发现，除DKK3 蛋白外，DKK3 基因还编码一种细胞质的、非分泌型的异构体DKK3b，DKK3b 填补了连接DKK3 基因与其调节β-catenin信号通路间的空白。

除了β-catenin 信号通路，DKK3 还可通过其他途径发挥抗肿瘤功能。DKK3 可通过诱导内质网应激触发JNK 激活，促进细胞型特异性caspase 依赖型凋亡[7]。还有文献报道，在卵巢癌细胞中DKK3可通过逆转上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）发挥抗肿瘤作用[8]。DKK3 还可能通过抑制肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭[9]。此外，目前认为DKK3 可能是一种新的免疫调节剂，激活了抗肿瘤免疫反应。有研究发现在外周血单核细胞中，DKK3 蛋白上调了单核细胞向树突状细胞样表型的分化，并随后激活了细胞毒性T 淋巴细胞的功能[10-11]。

2.2 DKK3 重要的失活机制DKK3 启动子区富含CpG 岛，已有研究证实在DKK3 启动子区域的异常甲基化状态是导致DKK3 表达下调、沉默的原因之一[12]。癌组织中DKK3 基因启动子区CpG 岛甲基化水平高于正常组织，这种高甲基化状态在多种恶性肿瘤（如非小细胞肺癌、结肠癌、肝癌）中均被检测到[13]，且DKK3 基因甲基化水平及表达情况与疾病严重程度、预后好坏有关。鉴于DKK3 基因异常甲基化在多种肿瘤中均可检测到，其可作为判断患者发病、复发、预后的生物标志物，较传统的肿瘤标志物具有更高的敏感度及特异度，在疾病的诊断、监测等方面具有重要价值。

2.3 DKK3 是肿瘤治疗中的潜在靶点基因启动子甲基化的潜在可逆性为新型抗癌药物的开发提供了机会。有研究发现，去甲基化治疗可以恢复DKK3在胃癌细胞中的功能，即促进癌细胞凋亡并抑制其增殖[14]。近年来，随着表观遗传学的发展，一些DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）抑制剂（如5-氮胞嘧啶、地西他滨等）得以开发，这些药物可重新激活表观沉默的肿瘤抑制基因，并被成功地用于治疗包括口腔鳞状细胞癌在内的多种恶性肿瘤[15]。

此外，DKK3 靶向性肿瘤治疗，即肿瘤内注射携带REIC/DKK3 基因的腺病毒载体（adenoviral vector，Ad）也是一种前景广阔的基因治疗方法。该方法通过启动DKK3 基因在恶性组织中的重新表达来诱导癌细胞凋亡。据报道，第2 代腺病毒介导的DKK3 全长cDNA 在小鼠异种移植瘤模型中的表达能发挥抗肿瘤作用[16]。现在，有研究正在探讨Ad-REIC 在肝癌[17]等恶性肿瘤治疗中的临床应用。总之，DKK3 可能是一个潜在的抗癌靶点，但尚需进一步研究来验证基因治疗的可行性。

3 DKK3 与宫颈癌的相关性

宫颈癌是威胁全球妇女健康及生命的主要恶性肿瘤之一，目前其发病率为女性恶性肿瘤的第4 位，也是妇女恶性肿瘤死亡的第4 大原因[18]。众所周知，高危型人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染是宫颈癌发生的主要病因，基于此，HPV 疫苗的应用和宫颈癌筛查使宫颈癌的发病率显著降低。但宫颈癌发病率和死亡率在发展中国家仍居高不下，其依然是一项全球性的重大健康挑战[19]。据估计，2018年我国有10.6万新发病例和4.8 万例死亡[20]。目前关于宫颈癌的研究已广泛开展，但其具体发病机制及协同因素仍有待阐明。

随着对宫颈癌表观遗传学机制的深入研究，发现原癌基因、抑癌基因及相关调节基因的分子生物学异常改变与宫颈癌的发生发展密切相关。不同的研究报道了宫颈癌患者中经常发生改变的不同组基因，而DKK3 是其中具有代表性的抑癌基因之一。2009年，Lee 等[21]首次发现，与正常宫颈组织相比，宫颈癌组织中DKK3 mRNA 表达常下调，并与其启动子区高甲基化有关，这一结果与DKK3 在多数肿瘤中的表现一致。研究表明，Wnt/β-catenin 信号通路在人子宫颈角质形成细胞恶性转化过程中被激活，β-catenin 结构和信号特性的不平衡参与宫颈癌的发生发展，最终宫颈癌组织中β-catenin 在细胞质和（或）细胞核中异常积累。宫颈癌中DKK3 蛋白作为β-catenin 的负调节因子发挥作用，其下调参与了β-catenin 信号通路的激活。一方面DKK3 蛋白抑制β-catenin 的转录活性，降低β-catenin 表达，并阻断β-catenin 向细胞核的转运使其失活；另一方面通过与含有β 转导素的重复蛋白（βTrCP）的协同作用增强DKK3 蛋白对β-catenin 的抑制作用，促进βcatenin 降解（或）核转运，最终导致β-catenin 下游靶基因（VEGF、Cyclin D）表达减少[21]。之后，Ryu 等[22]通过免疫组织化学法证实在50%的宫颈原位癌及64.8%的浸润癌中DKK3 蛋白的表达低于正常对照组。Luo 等[23]的研究表明，DKK3 是HeLa 细胞中miR-92a 的直接靶基因，其蛋白表达受miR-92a 的负调控，DKK3 的过表达减弱了miR-92a 对宫颈癌细胞活力和侵袭的促进作用。宫颈癌的发生发展机制复杂，是一个多因素、多基因、多步骤协同参与的过程，DKK3 参与的详细机制尚未完全清楚。

DKK3 可作为治疗宫颈癌的靶基因。研究发现将DKK3 导入HeLa 宫颈癌细胞后，抑制β-catenin表达，同时细胞集落形成减少，细胞生长减慢，这提示DKK3 蛋白对宫颈癌细胞具有抗增殖活性[21]。此外，最近的研究发现DKK3 过度表达促进宫颈癌HeLa 细胞中Bcl-2 相关X 蛋白（Bax）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达，抑制B 细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）在细胞中的表达，最终抑制HeLa 细胞的增殖、迁移和侵袭，促进癌细胞凋亡[24]。

目前一些研究对宫颈癌患者中DKK3 表达水平与预后相关性进行了分析。宫颈组织中DKK3 蛋白高表达的患者总体生存率和肿瘤缓解率均较高，DKK3 蛋白低表达则与宫颈癌患者的不良临床结局有关[22]。Jiang 等[25]研究发现，宫颈癌患者血清DKK3蛋白水平明显高于正常人，且与临床分期、肿瘤直径有关，表明血清DKK3 蛋白水平低对患者预后不良有较好的预测作用。在基因甲基化方面，van der Meide等[26]研究表明癌组织中DKK3 启动子甲基化频率显著高于正常宫颈组织，且与宫颈鳞状细胞癌相比，宫颈腺癌中DKK3 甲基化频率明显升高。2018年，Zhang等[27]进一步发现38%的宫颈腺癌组织中有DKK3 启动子甲基化，而在正常宫颈组织未发现。DKK3 基因的甲基化水平随肿瘤的浸润和转移而升高，与宫颈腺癌的预后密切相关，可用于宫颈腺癌患者预后和治疗效果的评估[4]。Kang 等[28]则证实了DKK3 甲基化对预后不利，并首次通过比较定量的甲基化分析确定了与宫颈鳞状细胞癌患者无复发生存相关的DKK3 启动子区域第1 位甲基化水平的阈值（26.3%），进一步确定了预测疾病复发的新的临床-表观遗传组合，旨在对宫颈癌患者进行更精确地分层，优化治疗方案。

总之，DKK3 基因启动子甲基化是宫颈癌中的频发事件，这为宫颈癌发病机制的研究提供了新的思路，也为宫颈癌的治疗提供了新的方向。DKK3 可能作为宫颈癌新的治疗靶点，并在宫颈癌的分期预测、预后评估中可能有所作用。

4 结语与展望

宫颈癌的发生是体内外等多方面因素共同作用的结果。尽管目前的研究已经证实DKK3 参与了多种肿瘤的发生发展，但对其作为抑癌基因在宫颈癌分子发病机制中的作用仍知之甚少，其与其他癌基因及抑癌基因之间的相互作用机制尚需进一步探索。随着对DKK3 基因的进一步深入研究，其可能会成为宫颈癌诊断、治疗及其预后的指标，并为阐明宫颈癌的发生机制及行基因治疗提供新思路。