微透析技术在药动学及药动学-药效学模型研究中的应用进展
2021-11-29胡贺佳陈艳王爱民王永林巩仔鹏
胡贺佳,陈艳,王爱民,王永林,巩仔鹏
(贵州医科大学 1. 贵州省药物制剂重点实验室/药用植物功效与利用国家重点实验室,2. 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心,3. 药学院,贵州 贵阳 550004; 4. 遵义市产品质量检验检测院,贵州 遵义 563000)
药物代谢动力学(简称药动学)是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律的一门学科。在创新药物研制过程中,药动学研究与药效学研究、毒理学研究处于同等重要的地位,已成为药物临床前研究和临床研究的重要组成部分。而生物样品的采集是药动学研究的首要环节,传统的取样方法主要是在特定时间点采集动物全血用于制备血浆或血清以及处死动物采集组织进行匀浆后处理分析,这种方法存在所需动物数量较大、前处理复杂、分析结果多为非游离型药物浓度、不能准确反映成分在机体内实时变化等缺点[1]。
在药动学-药效学(PK-PD)结合模型研究中,需要持续测定组织中的游离态药物浓度及其相应时间点的药理效应。传统取样不仅容易造成动物体液损失引起药物PK-PD行为的改变,而且长时间取样易使动物体液损失过多而死亡。微透析取样技术具有连续取样、动态观察、组织损伤轻、可在线检测等特点,在PK-PD研究中逐渐显示出巨大优势。同时,其可在多器官组织同时取样,为靶部位药物PK-PD的研究和阐明其作用机制提供了技术支撑。
随着微透析技术的日益成熟,其应用范围也从脑部逐渐扩展至心、肺、肝、胆、肾、眼、皮肤、血液等器官和组织,其中应用最广泛的部位包括脑、血液、皮肤、关节等[2-6]。本文对微透析技术在药动学及PK-PD研究中的应用进行综述,以期为药物的体内过程、作用机制以及靶向性研究提供参考。
1 微透析技术概述
微透析取样技术以半透膜的透析原理为基础,经相关微创手术将探针植入相应组织区域,通过微量泵以一定速率不断将灌流液泵入探针中,组织细胞外液中的待测物质便可根据Fick′s定律顺浓度差透过微透析膜进入灌流液中,将其连续不断地带出,并以一定时间间隔有序收集透析液[7],达到活体组织实时、连续取样的目的。因其只有小分子物质可以通过,避免了蛋白质等大分子对样品的干扰,可无须前处理,直接进行检测分析,避免了样品污染及操作误差,提高了实验结果的准确性,同时也提高了科研人员的工作效率。微透析技术可以在同一动物的不同器官,连续同时采样,减少了取样次数和动物数量,避免了体液损失对药物真实分布情况的影响及动物个体差异所引起的误差[8]。
2 微透析在药动学研究中的应用
2.1 基于脑部的微透析研究
微透析最早用于研究脑内神经递质的释放[9-10],且脑微透析技术已在实验室和各种临床应用中使用了几十年[11]。在中枢神经系统疾病中,脑血管病占大多数,具有发病率高、致残率高、复发率高以及死亡率高等特点,神经化学为神经系统疾病的病理生理学和药物机制提供了思路[12],而脑内药动学研究在了解中枢神经系统药物的药理作用及机制中扮演着重要角色。由于血脑屏障的存在,多数药物的血药浓度与脑中药物浓度存在差异,中枢神经系统药物的发现和发展受到严重阻碍,且传统的组织匀浆方法对结果存在诸多干扰。脑部微透析取样技术则是将脑作为靶部位,将探针植入海马区、纹状体、大脑皮层等部位收集透析液,并可实现清醒状态下(更接近于正常生理状态),实时、连续取样,客观评价药物在脑内的分布和消除状况,弥补了以往脑组织匀浆方法存在的不足,是一种能够定量游离药物的高灵敏度技术[13]。
宋宇尘等[14]基于脑部微透析技术,将探针植于大鼠前额叶皮质内,在清醒状态下收集透析液,研究安神定志灵对自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)多动、冲动行为及前额叶皮质单胺类神经递质及其代谢产物的影响。结果表明,安神定志灵能调控SHR多动、冲动行为,改善去甲肾上腺素、多巴胺缺乏状态。此外,他们还进行了探针回收率实验(发现影响探针回收率的因素有3个:温度、膜长与流速),指出在脑微透析实验中,探针回收率是关键问题。Wang等[15]利用脑部微透析取样结合液质联用技术,测定补阳还五汤中有效成分在中脑动脉阻塞大鼠脑脊液的药物浓度,并比较药动学特征。结果表明,与益气活血低剂量组相比,益气活血高剂量组能加速脑组织芍药苷达峰时间,显著提高脑组织中芍药苷最大浓度,为益气活血低剂量组的1.34倍。益气活血中、高剂量组的血药浓度-时间曲线下面积明显高于益气活血低剂量组。随着黄芪剂量的增加,芍药苷的脑靶向性增强,益气活血高、低剂量组脑靶向性有显著性差异。说明益气活血高剂量组对芍药苷在体内和脑内保持较长的有效作用时间,以及提高脑靶向性有很大的好处,从药动学角度验证了黄芪在补阳还五汤中用于益气活血的合理性。该项研究利用微透析结合灵敏度高、检测时间短的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术,获得了更加详细、完整的药动学参数,为其他中药复方的药动学研究提供了参考。Zheng等[16]也利用微透析技术研究了脑缺血状态下芍药苷的药动学行为。研究发现,与正常组相比,模型组(中脑动脉阻塞)给予黄芪桂枝五物汤后芍药苷在血液中最大浓度、曲线下面积升高,清除率降低;在脑中半衰期、表观分布容积降低。另外,Janson 等[17]采用微透析技术对清醒、自由活动的雄性SD大鼠脑间质液进行取样,并结合颈静脉取血方式获得血清及脑脊液吸取采样,通过非房室分析和群体建模方法研究静脉注射后化学修饰的重组磺酰胺酶和重组磺酰胺酶药动学。结果表明,两种化合物在给药后均以相当快的速度通过血脑屏障,达到平衡,这可能有利于到达大脑中的各种靶细胞。该项研究通过对血清、脑脊液及脑间质液的测定,比较其中药物浓度随时间变化的情况,明确药物透过血脑屏障的快慢以及在脑内分布,突破了传统取样技术收集数据不准确的局限。此外,国内外有多位研究人员均建立微透析脑部取样方法[18-21]。因此,采用微透析技术进行脑部的药物监测研究对脑部治疗药物、靶向给药等新型给药系统而言具有重要意义[8]。
2.2 基于皮肤的微透析研究
皮肤覆盖全身表面,是人体最大的器官,且具有吸收药物的作用。经皮给药能够克服传统口服给药带来的肝脏首过消除、服药量大(特别是儿童难以接受)、较难保持血药浓度、对胃黏膜的刺激以及注射剂一旦进入体内无法逆转的缺点[22]。施用于皮肤的药物在血液中的浓度往往很低,血药浓度并不能准确反映皮肤组织中真实的药物浓度,而经皮微透析直接对靶部位皮肤组织液进行采样分析,得到的药动学参数可更真实地反映药物透皮性能及其在皮肤的代谢情况[23-24],是直接评估皮肤中药物水平的首选技术[25]。
赖建辉等[26]应用经皮微透析技术研究双丹脂质体凝胶(SD-Lip Gels)和双丹凝胶(SD-Gels)的皮肤药动学过程,考察其在体经皮渗透性能。首先采用增量法和减量法考察微透析探针体外回收率,采用反透析法测定探针体内回收率,之后采用微透析技术采集不同时间的含药皮下组织样品,结合高效液相色谱(HPLC)测定样品中丹参酮ⅡA和丹皮酚的浓度,并用药动学分析软件DAS 2.0进行数据处理,计算相关药动学参数。结果表明,SD-Lip Gels可延长药物在皮下组织中的滞留时间及有效浓度,具有更优的缓释作用,可望成为双丹方经皮给药的新剂型。由于皮肤屏障的存在,血药浓度并不能衡量经皮药物的生物等效性,且皮肤给药制剂作用于皮肤组织,一般血药浓度都很低,难以检测到相关药物。该研究应用经皮微透析技术,测定给药部位皮下组织中游离药物浓度,获得了药物实时药动学数据,较好地观察药物在动物体内的吸收、分布、代谢、排泄等局部药动学过程。周开等[27]建立蛇床子素在体皮肤微透析采样方法,研究蛇床子软膏在SD大鼠体内的局部药动学。该项研究采用浓度差法考察浓度、流速对探针体外回收率的影响;减量法研究探针的体内回收率稳定性。探针植入SD大鼠皮肤后将蛇床子软膏涂敷于探针所在皮肤表面,测定微透析液中蛇床子素浓度,绘制药时曲线,计算药动学参数。黎晓丽等[28]以小鼠为实验对象,分别给予制川乌凝胶和制川乌-白芍凝胶,利用皮肤微透析技术以生理盐水为灌流液,灌流速度2 μL/min,每30 min收集1次,共收集8 h。采用HPLC-MS/MS测定制川乌中6种生物碱的含量,并绘制浓度-时间曲线,计算药动学参数并对其参数进行SPSS分析,研究制川乌-白芍配伍对制川乌中6种生物碱透皮吸收的影响。结果表明,制川乌-白芍配伍促进了单酯型生物碱的经皮渗透,抑制了部分双酯型生物碱的吸收,该研究从经皮转运的角度阐明了制川乌-白芍“增效减毒”的配伍机制,同时也为其他药对配伍机制的研究提供参考。另外,李怀国等[29]采用HPLC-MS/MS技术建立SD大鼠皮肤微透析液中乌头碱含量的测定方法,考察玉龙散中乌头碱的透皮吸收过程。吴丽颖等[30]建立了大鼠在体皮肤微透析技术,并应用于创伤涂膜剂经皮给药的药动学研究。张紫萍等[31]采用微透析法研究雷公藤甲素在正常和糖尿病大鼠皮肤中的药动学差异,为其临床合理应用提供参考。以上研究表明微透析技术在经皮给药研究中起着重要作用,将会大大推动经皮给药制剂的药物检测及新剂型的开发。
2.3 基于关节的微透析研究
骨关节疾病是人类高发的疾病类型之一,研究治疗关节疾病的药物很有必要。但传统的关节局部药动学的分析方法大多是将动物在规定的时间点处死,冲洗关节处,将关节液抽出,与其他设备联用测定其中的药物浓度,建立药动学研究曲线,这样需要耗费大量的实验动物,也不能完成连续取样。而微透析技术取样量少,不会导致实验动物体液流失过多而使实验数据不准确,该技术只需在关节部位完成一个微创手术,可以完成在体实时连续的取样,与传统技术相比更有说服力[32]。
Wang等[10]建立微透析-UPLC-MS/MS测定佐剂性关节炎大鼠关节腔透析液中栀子苷的含量。采用反向透析技术计算药物在体内的流失量,以估算栀子苷在体内的相对回收率。通过关节两侧凹陷处将探针植入左腿髌骨与髌韧带连接处,微量注射泵的流量设定为1 μL/min,稳定1 h后口服给予栀子苷,每隔1 h采样1次,共8次(在整个取样过程中,大鼠处于麻醉状态),之后采用UPLC-ESI-MS/MS技术对微透析样品进行分析检测,可以应用于关节腔内药物的药动学研究。另外,占翔等[33]建立了 UHPLC-MS/MS 测定栀子苷和3 种牛膝皂苷成分(姜状三七皂苷R1、人参皂苷R0、竹节参皂苷IVa)在大鼠关节、血液透析液中药物浓度的分析方法,并应用该法研究牛膝总皂苷-栀子苷配伍前后在佐剂性关节炎大鼠体内的药动学过程。发现牛膝皂苷与栀子苷联用后,使栀子苷的关节腔药物浓度-时间曲线下面积/血浆药物浓度-时间曲线下面积达到栀子苷单用的2倍,表明牛膝皂苷可以提高栀子苷向关节腔靶向分布的程度,对栀子苷具有靶向引导作用,增加栀子苷在关节腔浓度。上述研究均利用微透析技术结合分离能力好、灵敏度高的UPLC-MS/MS技术,为关节腔内药物分析提供一种更加简便、动态的分析方法,推动关节靶部位药物的研究。
2.4 基于血液及其他部位的双位点、多位点微透析研究
一般而言,尽管药理作用通常发生在组织中而不是血液中,但医学实践中的诊断和治疗通常仍然依赖药物和(或)生物分子的血液浓度。而血液作为最常见的生物样本,其传统的采集方法主要有尾部采血(割、剪鼠尾),眼眶静脉丛采血,断头采血,心脏采血,颈静脉(动脉)采血,腹主动脉采血,股动(静)脉采血等,都会对动物造成不同程度的损害,且体液损失严重,生理状态与正常机体存在一定差异。且血液成分复杂,内源性物质干扰大,前处理过程烦琐,很大程度影响了药物研究的准确性及效率。而微透析技术基于半透膜的原理,避免了大分子物质的干扰,且大大降低了体液的损失,保证了动物的机体状态。
Zhou等[34]成功地建立了一种基于微透析和UHPLC-MS/MS联用的新方法,并将其应用于正常和心肌梗死大鼠口服四逆汤后苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头碱和苯甲酰次乌头碱的药动学比较研究。首次发现正常大鼠与心肌梗死大鼠口服四逆汤后,苯甲酰新乌头碱、苯甲酰乌头碱和苯甲酰次乌头碱的药动学特征有显著性差异。与正常大鼠相比,心梗大鼠血药浓度低,清除慢,分布延迟,全身暴露少,无毒,有明显的心脏保护作用。研究结果为了解四逆汤的代谢特征和治疗效果提供了实验依据。另有诸明娜等[35]结合微透析技术建立HPLC法测定大鼠血浆中五味子甲素含量,探讨其在大鼠体内的代谢过程。
近年来,随着微透析技术的逐渐成熟,基于血液及其他部位的双位点、多位点的微透析被更为广泛的应用[36-38]。Mi等[39]以血瘀型偏头痛患者为研究对象,采用血脑双位点微透析技术,收集透析液,结合UPLC-MS法研究了不同浓度天麻素和天麻苷元对川芎嗪和阿魏酸药动学行为的影响。结果显示,天麻素和天麻苷元能提高川芎嗪和阿魏酸的脑靶向性,说明天麻素和天麻苷元能提高川芎嗪和阿魏酸通过血脑屏障的渗透速率,使川芎嗪和阿魏酸迅速到达脑组织。同时,他们推测天麻素和天麻苷元降低了血脑屏障的通透性,增加了川芎嗪和阿魏酸在脑内的生物利用度和滞留时间,延缓了川芎嗪和阿魏酸在脑内的清除率。该项研究在一定程度上阐明了川芎与天麻配伍治疗血瘀型偏头痛的药理机制,为临床用药提供了科学依据,为今后相关药物配伍研究提供了参考。此外,Yan等[40]研究了阿魏酸经皮或灌胃后在大鼠血浆和皮肤微透析液中的药动学行为。Xu等[41]同时利用微透析取样技术、稳定同位素标记法及超高效液相色谱-高分辨率质谱(UPLC-HRMS)建立了测定大鼠脑和血液中尼古丁及其代谢物的新方法。该方法将微透析探针植入SD大鼠的右侧纹状体和颈静脉,采用优化的UHPLC-HRMS法对尼古丁腹腔注射后的透析液进行分析,以尼古丁-吡啶-d4为代谢示踪剂,用几种稳定标记的同位素对反透析的体内回收率进行了校正,为研究血脑屏障对药物通过及其速率的影响提供参考。
另外,杜清等[42]为进一步探究雷公藤白芍微乳凝胶在体内的代谢情况,建立了雷公藤白芍凝胶中雷公藤甲素和芍药苷的 LC-MS/MS 含量测定方法;采用浓度差法(增量法和减量法)测定了血液探针体外回收率。同时建立了雷公藤甲素和芍药苷皮肤和血液微透析方法,并通过微透析技术联合 LC-MS/MS定量分析技术对雷公藤白芍微乳凝胶的在体皮肤和血液的药动学进行了研究。杨盟等[43]也采用皮肤、血液双位点同步微透析技术研究雷公藤甲素普通凝胶、纳米乳、纳米乳凝胶在大鼠皮肤和血液中的药动学过程。结果表明,雷公藤甲素纳米乳和纳米乳凝胶在皮肤和血液中的AUC明显高于雷公藤甲素普通凝胶,且雷公藤甲素纳米乳凝胶缓释效果更加明显,显著提高了雷公藤甲素的生物利用度。上述研究均基于皮肤及血液双位点微透析技术研究药物的药动学行为,为经皮给药制剂进一步研究提供参考。
除此之外,多位点微透析技术也扮演着不可小觑的角色。欧咏[44]以三妙丸为研究对象,探讨微透析探针回收率的影响因素,并利用多位点微透析技术与UPLC-MS/MS联用技术,测定三妙丸中的小檗碱在大鼠血、肝脏、膝关节透析液中的浓度。该研究将不同类型的探针分别植入大鼠颈静脉、肝脏、膝关节,以枸橼酸-枸橼酸盐葡萄糖溶液为灌流液,分别以2.5、1.0、1.0 μL/min的流速灌流。探针植入平衡1 h后,大鼠灌胃三妙丸水提物,剂量为17.5 g/kg生药(苍术∶黄柏∶牛膝=3∶2∶2),收集微透析样品,透析液每隔30 min收集1次。利用UPLC-MS/MS技术对透析液进行分析,首次实现了大鼠血、肝脏、膝关节中的小檗碱药物浓度动态检测,为生物碱在大鼠体内的药动学研究提供了参考。由此可见,基于多位点微透析技术的药代动力学研究方法是可行的,是脑内单位点微透析技术的发展,将在阐明药物吸收、分布、代谢、排泄等体内过程,靶向性等方面发挥重要作用[45],与传统研究方法相比,拥有众多不可比拟的优势[46]。
3 微透析在PK-PD研究中的应用
PK-PD结合模型研究对阐明药物的药效物质基础及其作用机制具有重要意义,尤其对于阐明中药的药效物质基础和作用机制至关重要。但由于采样技术的限制,早期的PK-PD研究多用血液PK-PD模型来模拟作用部位的药物浓度与效应的关系,而微透析取样技术在PK-PD研究领域的应用,可实现几乎所有组织的取样,且可以同步测定透析液中药物浓度及药效指标含量,更加真实有效地反应药物浓度与效应的关系,为靶部位PK-PD的研究增添了一道曙光。
Wang等[47]从PK-PD角度对刺五加的药效物质基础和疗效进行深入研究,建立微透析-超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用(MD-UPLC-QQQ-MS)同时、连续采集和定量测定清醒缺血性卒中大鼠血浆和海马中与疗效相关的活性成分和内源性神经活性物质的方法。并将所得数据进行PK-PD分析,建立脑缺血区海马内PK-PD关系的可视化表达方法。Zhan等[48]建立了一个简单的自由活动大鼠血液微透析取样系统,同时研究生脉注射液对异丙肾上腺素诱导心肌缺血大鼠实时释放一氧化氮的影响,成功地建立了心肌缺血大鼠静脉注射10.8 mL/kg生脉注射液后SMI诱导一氧化氮释放的PK-PD模型,表征了生脉注射液的量效关系,具有良好的预测能力。Wang等[49]将新西兰兔随机分为空白对照组和4个实验组:ST36组(青藤碱足三里穴位贴敷)、GB34组(青藤碱阳陵泉穴位贴敷)、膝关节组(直接贴敷膝关节部位)和口服给药组(青藤碱灌胃给药)。各组在膝关节处进行微透析以获得样本,采用UPLC-MS/MS测定药动学和药效学参数,并根据所得参数建立PK-PD模型。结果发现,在ST36穴位敷贴青藤碱治疗类风湿关节炎的疗效优于GB34穴位贴敷、膝关节直接贴敷、灌胃给药。另有,Zhang等[50]首次将微透析应用于评价头孢喹肟对抗胸膜肺炎放线杆菌的PK/PD整合,为微透析研究PK/PD整合模型以及使用头孢喹肟治疗胸膜肺炎放线杆菌引起的动物疾病提供了有价值的参考。上述研究分别在脑、血液、关节腔、大腿利用微透析技术取样,结合液质联用技术,建立靶部位的PK-PD模型,为药物靶部位PK-PD研究提供参考,推动药效物质基础及作用机制深入研究。
4 结语
综上所述,微透析结合UPLC-MS/MS技术是目前药动学研究中应用最为广泛的方法之一。将微透析技术在体、实时、连续取样的特点,与UPLC-MS/MS技术速度快,特异性强,灵敏度、准确度、稳定性高等特点相结合,使药动学、药效学及PK-PD研究有了新的突破,从而推动新药开发及临床合理用药。
微透析作为一种新型的采样取样技术,拥有相当广阔的应用前景。但值得注意的是其存在以下局限性: ① 微透析探针的植入会对局部组织造成轻微的损伤,影响机体正常的生理活动,如产生炎症反应等,可能会对药物的代谢分布等有一定影响。② 微透析探针回收率受诸多因素的影响,如药物自身性质(脂溶性药物易吸附在探针上,从而影响回收率的测定),温度,流速,使用次数等。③ 微透析技术的取样量极少,对样品分析检测技术要求很高。④ 基于半透膜的原理,只有小分子可以通过,不适合大分子物质的采样,适用药物范围受到限制。⑤ 另外,微透析技术所需耗材昂贵,也是其重要局限性之一。微透析技术在近年来的应用中,也不断改进,逐渐成熟。可以预见,随着其广泛应用,将会改变药动学、药效学及PK-PD研究现状,加速药学研究进程,开创药学研究新面貌。