利用微透析技术在大鼠脑内取样的方法

代洁琼 贾欣 乔巧玉 王志华 赵欣 杜振莹 关晓雅 张宇

【摘要】 本文通过查询文献并结合笔者的实际操作经验，介绍微透析技术原理，以及利用微透析技术进行清醒大鼠rACC脑区定位取样的方法。

【关键词】 微透析； 透析液； 立体定位； rACC脑区； 大鼠

前扣带皮层（anterior cingulate cortex，ACC），尤其是其吻侧部（rostral ACC，rACC）是参与情绪情感反应的重要中枢[1-3]。已有研究证实，rACC也是伤害性刺激传入高位中枢时形成痛厌恶情绪的重要脑区[4-6]，那么在痛情绪发生时rACC脑区神经元释放的神经递质有何变化是我们所关注的。微透析技术正是一种可以探究这一問题的手段。该技术是将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的新技术，具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点[7]。目前，微透析技术主要应用于大脑、血液、脊髓等部位[8-11]，通过定位后取样再检测，观察目标神经递质的相对变化，可在麻醉或清醒的生物体上使用。在清醒生物体上进行微透析实验比起麻醉生物体，取得的样本会更接近于正常生理状态[12]。但由于动物处于可自由活动的状态，存在很多不确定因素，因此实验中所需的条件和对动物的各种操作均要在不断地摸索和尝试中确定。笔者通过查询文献并结合作者的实验操作经验，介绍利用微透析技术进行清醒大鼠rACC脑区定位取样的方法，现报道如下。

1 定位

1.1 微透析探针的选取 微透析探针的供应商有瑞典的CMA公司，美国的BAS公司和日本的EICOM公司，另外也有实验室采用自制的微透析探针。本实验室采用的是EICOM公司的探针，根据定位脑区的深度和所需检测的目标神经递质的分子量大小（一般检测的神经递质为氨基酸类神经递质和单胺类神经递质），选择所需的探针规格。EICOM公司的脑组织探针主要有三个系列，本实验室选用的探针样式为A-Z系列带有导管、内芯和导管配套的螺帽，探针规格为管长4 mm，膜长2 mm，膜材料：人造纤维素，50 kDa截留分子量，见图1。

1.2 埋置导管定位手术 雄性SD大鼠，250～270 g，1%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠（40～50 mg/kg）成功后，将其固定于脑立体定位仪上。切开头皮，清除皮下筋膜，暴露颅骨，以前囟（Bregma）点为0点，根据Paxinos & Watson图谱[13]rACC坐标，AP：+2.6 mm，ML：±0.6 mm，DV：-2.8 mm，见图2。将导管埋置于rACC定位标记点，插入导管对应的内芯，拧上螺帽，后用牙托水泥固定。固定时应注意将头皮和牙托水泥接缝处分开，有助于脓血的渗出。术后3～5 d即可进行微透析实验。实验结束后向取样部位注入染料，病理切片观察定位是否准确。

2 基本原理

将带有透析膜的探针定位于需采样的生物体组织，用一种非常精密的注射泵进行液体灌流，推送溶液至探针处，以达到与组织内欲取出测量的低分子量物质，进行透析交换。交换后的透析液被采集，通过高效液相或其他仪器做进一步的分析，见图3。

3 取样

3.1 取样前准备 温度恒定24 ℃，灌流液选用复方氯化钠溶液，因为其pH值和渗透压均和脑脊液相似，以此作为人工脑脊液进行灌流，过滤器过滤后，备用。进行取样前连接好微透析泵、注射器、清醒活动装置、样品低温收集器等装置。准备1 mL的注射器，充满三蒸水，固定于微透析泵上，打开微透析泵低速（1 μL/min），使微透析管道内充满三蒸水，以充分排出管内气体。

进行探针检测：用管路接头和管路连接探针的入口与注射器针头（长进短出，黄进蓝出）；以低速（1 μL/min）向探针注射三蒸水，若整个探针膜表面有湿润或“流泪”现象出现，则该探针正常，可以使用；若观察到探针膜某处成股状流出三蒸水，说明探针膜有破损或漏洞，应更换探针。

3.2 清醒大鼠取样 取样装置和取样示意图，如图4、5所示，在取样前应先将大鼠放入装置适应15 min，以减少环境对动物的新异刺激。开启透析泵使灌流液充满整个管路，然后将导管中的内芯取出，装备插入探针，插入探针前用三蒸水或人工脑脊液多次冲洗导管内，防止导管内有异物堵塞导管，损毁探针。使大鼠处于气体麻醉状态下，迅速插入并固定探针，将大鼠放回装置待其清醒后，打开恒流注射泵开始灌流透析。用复方氯化钠以2 μL/min的速度收集样品，因为插入探针时的刺激、微透析液中混有破碎细胞的细胞内成分等都会对检测结果造成一定的影响，所以开始取样后60 min（平衡时间）透析液弃去不用，待目标神经递质检测结果达到稳定，便可定时收集样本至-80 ℃保存。若收集的脑脊液用来测单胺类的神经递质，则需在收集管中加入稳定剂（稳定剂：收集的脑脊液=1︰4）。稳定剂配制方法：若配制100 mL稳定剂：0.01 g Na2EDTA，220 μg抗坏血酸，0.6 mL无水乙酸，加水至100 mL。

收集样本时除了要时刻观察探针是否脱出外还应注意每管收集液的体积是否大致相同，如出现明显的差异则说明探针的透析膜出现损害或者微量泵出现偏差，应立刻停止实验，确定问题出处后重新开始。另取样速度和平衡时间的选择要适当，两者成反比，当速度过快时，平衡时间长，透析液中神经递质含量过低。当速度过慢时，平衡时间短，但不利于实验设计。

取样方法成功的标准为：平衡时间后，每隔10分钟连续收集三管透析液，能够在透析液中检测出目标神经递质的含量，并且几次检测的数据不具有统计学差异，可认为目标神经递质在平衡60 min后达到稳定状态[14]。

4 取样后管路和探针的清洁和保养

探针的清洗和保存：取样结束后，立即取出探针，放入三蒸水中。将探针与管路连接，用1 μL/min的速度冲洗过夜，充分排出管路和探针中存留的盐分后，取下探针，放入三蒸水中于4 ℃冰箱保存，用于防止探针透析膜收缩。若透析液体积和灌流液体积不一致，可能是探针被凝固的血液堵塞，可将探针置于胰蛋白液中，待可见物质从探针膜端剥落即取出。

管路在冲洗完毕后，自然晾干，密封出入口，置于低温条件保存，防止细菌滋生。

5 讨论

微透析技术在神经科学、医药研究等领域已获得越来越广泛的应用[15-20]。可以用于实时的神经递质变化的检测，不同于组织匀浆技术，不需要破坏机体的完整性，可维持在生理状态下神经递质检测。微透析实验和其他很多实验不同，很多方面取决于操作者的技能水平[21]。本文通过笔者的实验操作经验，介绍利用微透析技术进行清醒大鼠rACC脑区定位取样的技术要领。

在实验操作时应注意：（1）探针的选择要根据所检测部位的定位深度和神经递质分子量的大小，选择所需的规格；（2）探针埋置定位要准确，可根据脑图谱（AP、ML、DV值）要准确，微透析实验结束后要进行病理切片观察定位是否准确；（3）在取样前连接管路后，微注射器充满三蒸水后，进行灌流观察管路是否有漏液或堵塞，同时检测探针透析膜是否完好，是否可以使用；（4）插入探针前用三蒸水或人工脑脊液多次冲洗导管内，防止导管内有异物堵塞导管，损毁探针；（5）插入探针时，确定大鼠处于气体麻醉状态，插入探针时要特别注意不要损坏探针膜，延长探针的使用寿命和次数；

（6）取样时要注意平衡时间和取样速度的确定，单胺类神经递质要在收集管中加入稳定剂；（7）取样成功的标准为平衡时间后，每隔10分钟连续收集三管透析液，能够在透析液中检测出目标神经递质的含量，并且几次检测的数据不具有统计学差异；（8）取样后要注意管路和探针的清洁和保养，连接管路和探针，三蒸水低速灌流过夜，排出管路和探针中残余的盐分；（9）清洁完毕后，探针置于三蒸水中4 ℃冰箱保存，管路自然晾干，密封开口，低温保存。

本文总结了笔者在进行微透析实验时，定位和取样以及取样后探针的清洁与保存的操作方法，为类似的脑区定位微透析取样实验提供方法依据。

参考文献

[1]王媛.前扣带皮层神经元NMDA受体在痛情绪形成中的作用观察[D].太原：山西医科大学，2016.

[2] Issue R.Local Heroes vs Central Government in Tajik East[J].Pain，2012，146（1-2）：183-193.

[3]张肖怡.激活前扣带皮层神经元μ阿片受体可缓解大鼠的痛情绪反应[D].太原：山西医科大学，2014.

[4]韩梅.大鼠前扣带皮层SIP30参与痛厌恶情绪反应的细胞分子机制[D].天津：复旦大学，2011.

[5] Kim E，Kyeong S，Cheon K A，et al.Neural responses to affective and cognitive theory of mind in children and adolescents with autism spectrum disorder[J].Neurosci Lett，2016，621（72）：117-125.

[6]唐雨龙，张玉秋.前扣带皮层NMDA受体-MAPK-CREB通路参与痛厌恶情绪的分子机制[J].生理学报，2017，69（5）：637-646.

[7]韩慧婉，舒鸿钧，刘国诠.微透析技术及其应用[J].化学通报，2000，63（12）：52-56.

[8]杨盟，杨帝顺，唐晓萌，等.基于皮肤、血液双位点同步微透析技术的雷公藤甲素纳米乳体内药动学研究[J].中国药学杂志，2018，53（11）：894-899.

[9]刘奇，杜萍，施晓兰，等.脑微透析探针置入对大鼠海马葡萄糖、乳酸水平的影响[J].成都中医药大学学报，2018，41（2）：8-10.

[10]吕扬，张雅文，谭磊，等.脊髓损伤模型中胞外抗坏血酸浓度的活体在线分析[J].分析化学，2017，45（11）：1595-1599.

[11]陈腾飞，刘建勋，宋文婷，等.人参皂苷Rg1脑、血微透析探针体内外回收率研究[J].中国药学杂志，2018，53（06）：434-438.

[12]樊官伟，高秀梅.微透析技术及其应用进展[J].时珍国医国药，2006，17（9）：1781-1782.

[13] Hargreaves K，Dubner R，Brown F，et al.A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia[J].Pain，1988，32（1）：77-88.

[14] Kealy J，Bennett R，Woods B，et al.Real-time changes in hippocampal energy demands during a spatial working memory task[J].Behavioural Brain Research，2017，326（5）：59-68.

[15]刘健，吴嘉敏，方平飞.微透析技术在肿瘤药物研究中的应用进展[J].中国医院药学杂志，2018，38（7）：792-795.

[16]杨邦坤，陈谦学.脑微透析技术在神经科学中的应用进展[J].中华实验外科杂志，2017，34（8）：1430-1432.

[17] Crick E W，Osorio I，Frei M，et al.Correlation of 3-Mercaptopropionic Acid Induced Seizures and Changes in Striatal Neurotransmitters Monitored by Microdialysis[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences，2014，57（1）：25-33.

[18]李朝晖，魏君.脑微透析监测在动脉瘤性蛛网膜下腔出血中的应用进展[J].国际神经病学神经外科学杂志，2018，45（1）：87-90.

[19]李玉洁，龚曼，魏丹丹，等.微透析技术在中药归经理论研究中的应用[J].社区医学杂志，2018，16（1）：80-82.

[20]管咏梅，肖芳，金晨，等.微透析技术在中药外用制剂中的应用[J].中国新药雜志，2017，26（5）：530-534.

[21]万海娇，杨丽萍，李新民，等.微透析取样技术及其在脑内研究中的应用进展[C].中华中医药学会中医基础理论分会第九次学术年会，2015.

（收稿日期：2018-05-07） （本文编辑：程旭然）