巨噬细胞与非酒精性脂肪性肝炎关系的研究*

施铃灵，卞兆连，邵建国

(南通大学附属南通第三医院消化内科，南通 226006)

非酒精性脂肪肝性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成为全球最常见的慢性肝病，影响到20%～30%的普通人群，其发病率普遍上升[1-2]，代表着一系列进展性发展的肝病，包括单纯的脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、相关肝硬化及潜在的肝细胞癌[3-4]。NAFLD的特点是循环中的游离脂肪酸增加、肝氧化损伤、内质网应激和脂质失衡。

尽管目前有大量对NAFLD 及NASH 的研究，但其发生发展的机制仍是个未解之谜。最早提出“二次打击”学说，即早期的脂肪变性和随后的炎症阶段。新的研究[5]结果对早期的“二次打击”学说提出质疑，目前普遍公认的是“多次打击”学说，即多个危险因素可以共同作用导致NAFLD 的进展。首次打击是指脂肪在肝脏实质细胞内的过度积聚导致肝脏脂肪变性，从而增加了肝脏对炎症损伤的敏感性。第二次打击是在首次打击的基础上，各种氧化代谢产物、脂肪细胞因子、脂质过氧化物、炎症介质等产生的活性氧及其代谢产物增加，导致氧化应激和内质网应激，当产量明显超过了机体自身去毒及防御范围，两者间的动态平衡失调，激活肝脏的免疫细胞，将最终导致肝脏实质细胞由单纯的脂肪变性向肝细胞炎症、坏死以及纤维化方向发展[6]。第三次打击是肝脏免疫功能紊乱所导致的肝脏纤维化及肝硬化。

肝脏有丰富的巨噬细胞，每100 个肝细胞中就有20～40 个巨噬细胞[7]。巨噬细胞作为免疫细胞，在组织内稳态和疾病进展中具有不同的天然免疫功能，它们识别、摄取和降解细胞碎片、外来物质或病原体，调节代谢紊乱时的炎症反应，可刺激或消除肝纤维化，是抵御感染和组织损伤的第一道防线。因其来源及微环境的差异，肝巨噬细胞功能具有多样性，因NAFLD 的饮食组成、代谢或炎症刺激而改变，部分可由异质性的巨噬细胞亚群来解释，即驻留型巨噬细胞(Kupffer 细胞)和浸润型巨噬细胞(monocyte derived macrophages,MDMs)，它们在个体发育、表型和功能特征上均有区别[8]。Kupffer 细胞来源于卵黄囊，驻留在肝窦、门静脉和肝淋巴结中[9]，与肝窦内皮细胞密切接触[10]，对抗来自肠道的微生物、病原体或异物。在肝损伤时，血液循环内骨髓原性的单核细胞——MDMs 与Kupffer 细胞发挥协同作用[11]。目前认为，NASH 患者的肝相关细胞因子表达与相应的肝脏病变的严重程度呈正相关，通过刺激Kupffer 细胞分泌促炎介质和在肝脏内招募白细胞导致肝脏炎症[12]。利用模拟代谢疾病的小鼠模型进行的多项研究[13-15]表明，肝巨噬细胞的活化和极化影响NAFLD和NASH 的进展。巨噬细胞的炎症极化与核心代谢通路的改变有关，如氧化磷酸化和糖酵解等。一些营养物质，如葡萄糖、脂肪酸甚至氧气都会影响巨噬细胞的分化或细胞因子的接收[16]。

NAFLD 的特点是过量的脂肪酸和脂质在肝脏中的积累，脂肪细胞增大促进脂肪细胞破裂，巨噬细胞和T 细胞等免疫细胞的募集和激活，脂肪细胞因子释放入循环进入肝脏，导致局部炎症，增加游离脂肪酸在肝脏中的积累产生脂质毒性及胰岛素抵抗，在内质网和线粒体中产生脂质毒性应激，释放肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体，诱导肝细胞凋亡[17-19]，从而造成肝损害。同时，由于高脂摄入，肠上皮通透性增加，肠道屏障破坏，有利于细菌和细菌产物异位至门静脉，进而导致病原体相关分子模式介导的Kupffer 细胞活化[20]。在NAFLD 的早期和慢性阶段，并不存在明显的肝细胞坏死，而巨噬细胞及淋巴细胞浸润是其重要特征，通过清除巨噬细胞可阻止NASH 进程，从而可证明巨噬细胞在NASH 中的致病作用[21]。炎性巨噬细胞和星状细胞的激活促进了脂肪变性向NASH 进展[22]。

在NAFLD 中，按照活化状态不同，巨噬细胞可分为M1 型巨噬细胞(经典激活巨噬细胞)和M2 型巨噬细胞(替代活化巨噬细胞)[23]。M1 型巨噬细胞以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和γ 干扰素(interferon-γ,INF-γ)信号传导为主，与促炎细胞因子和趋化因子的产生有关，其诱导的细胞因子对宿主有很重要的防御作用，但在慢性炎症的情况下可诱导组织损伤和免疫细胞激活，发挥促炎作用[24]。M2 型巨噬细胞通常通过白细胞介素(interleukin,IL)-4/13、Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号途径、IL-10 等诱导炎症反应，其产生的细胞因子和生长因子刺激新血管和瘢痕的形成，与伤口愈合和疾病恢复有关，对于组织重塑和慢性肝病的发病机制至关重[25-26]。很多实验探讨巨噬细胞介导的的机制，如对抗LPS 信号传导，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNFα)及还原型辅酶Ⅱ氧化酶从而减轻脂肪肝和炎症。在一项不同品系小鼠巨噬细胞激活模式与NASH 易感性差异的研究[15]中发现，在蛋氨酸胆碱缺乏(methionine-choline-deficient,MCD)饮食喂养4 周建立起NASH 模型，肝脏组织学显示有大血管脂肪变性，伴有小叶炎症、脂肪肉芽肿、肝细胞凋亡和局灶性坏死。从转氨酶、肝脏组织半定量评估等评估NASH 的严重程度，结果表明C57BL/6 小鼠比Balb/C 小鼠NASH 程度更重。研究结果还表明了M1 反应在NASH发生发展中的重要性，即MCD 诱导的C57BL/6 小鼠肝脏炎症的增加与M1 的表达有关。此外，在无症状的早期NASH 中，M1 促炎巨噬细胞活化是其主要特征，可作为合理的治疗靶点[27]。M1/M2 平衡的破坏可能影响巨噬细胞的发育、内环境平衡和疾病，在NASH 患者及动物实验中均发现肝巨噬细胞表型的缺陷，除了吞噬作用外，肝巨噬细胞还可能刺激机体的免疫功能。S.S.RENSEN 等[28]研究表明NASH 患者肝活检中大量沉积不同补体，与肝细胞凋亡、粒细胞浸润和IL-1β、IL-6 和IL-8 的mRNAs 的高表达有关，补体级联通道通过C3b 和C5b 受体相互作用活化噬菌体及释放过敏性毒素。这些结果表明C57BL/6小鼠在肝巨噬细胞反应中的M1 偏倚有助于增加该菌株对NASH 的易感性，遗传/表观遗传因素调节噬菌体活化在NAFLD 进展为NASH 中至关重要。在动物模型中，消耗或修复肝巨噬细胞，因补体C3a 和(或)C5a 缺乏引起的损害会减弱肝脏的再生[29]。肝脏再生由缺陷的巨噬细胞活化引起，可能需要考虑修复巨噬细胞功能刺激再生来用于治疗NASH 患者[30]。由此可见，巨噬细胞的极化与NAFLD、NASH等慢性肝病的发病机制和进展密切相关。

巨噬细胞释放细胞因子受多种因素的影响，如模式识别受体或细胞因子受体激活，以及JUN 氨基末端激酶(JUN amino-terminal kinase,JUK)和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)依赖的炎症基因表达上调，及NOD-、LRR-和NLRP3 炎症小体的形成[31]。大多数巨噬细胞表达多种模式识别受体，其中TLRs 是迄今为止最好的特征。TLR-4、TLR-2 和TLR-9 被证明能触发肝脏炎症反应，并被脂质、氧化产物和受损肝细胞所释放的分子所激活。当LPS 激活TLR4 信号通路时，CD14 激活Kupffer 细胞，增加了细胞对LPS 的敏感性。其他TLRs 特异性识别危险信号如细菌肽聚糖、鞭毛蛋白、游离DNA 或线粒体DNA[32]。TLR9 识别游离线粒体DNA。受损肝细胞释放的微粒中包含线粒体DNA，NASH 患者血清中线粒体DNA 水平升高。巨噬细胞可以通过TLR9 识别线粒体DNA，缺乏TLR9 的小鼠可以避免高脂肪饮食引起的肝损伤[33]。研究[34]发现，与食物控制组分离的线粒体DNA 相比，从NASH 小鼠中分离的Kupffer 细胞线粒体DNA 可诱导更强的炎症反应。表明Kupffer 细胞可以通过TLR9 识别线粒体DNA，从而感知肝损伤的严重程度。TNF-α 通过促进骨髓来源的单核细胞浸润而被证明是NASH 的重要因素，通过死亡受体激活细胞凋亡和坏死，并通过NFκB 通路介导炎症信号[35]，维持组织中单核细胞来源的巨噬细胞的生存及平衡[36]，在NASH 的发展过程中起着重要作用。此外，肝巨噬细胞招募CD4+T 细胞进入肝脏，然后通过INF-γ 及CD40L 激活肝巨噬细胞导致NASH 进展。NF-κB、MAPK、ERK 1、p38、JNK和IRF3 信号通路也被证明参与激活Kupffer 细胞的过程[37]。

Kupffer 细胞具有免疫原性，在正常情况下表现为M2 样表型并表达多种受体，与肝窦内的多种免疫细胞相互作用，包括T 细胞、树突状细胞、肝星状细胞和先天淋巴细胞，诱导T 细胞活化和产生有效的细胞毒性T 淋巴细胞反应。由于长期的肝细胞脂质积聚，Kupffer 细胞被激活，驱动中性粒细胞和单核细胞等炎性细胞，一旦向M1 表型激活，就会释放大量的炎性细胞因子和趋化因子。单核细胞来源的巨噬细胞主要通过CCL2-CCR2 轴进入肝脏[38]。缺乏胆碱的氨基酸所致的脂肪变性、炎症细胞浸润和肝纤维化增加了CCL2 及其受体的表达[39]。基于此，促使了对这些途径的药物抑制剂进行了一些实验研究[40]。C.BAECK 等[41-42]发现mNOX-E36 通过结合抑制CCL2，减少了NASH 小鼠肝内巨噬细胞和促炎细胞因子的含量，改善了MCD 饮食小鼠的肝脏脂肪变性，靶向肝巨噬细胞是治疗肝脏疾病的一种很有前途的方法。最近有报道[43-44]，双CCR2/CCR5 拮抗剂西尼维罗能显著减少纤维化和NAFLD 活性评分，肯定了巨噬细胞在NAFLD 中的作用。

肝巨噬细胞参与NAFLD 的进展过程，但目前在靶向人肝巨噬细胞方面仍有很多难题有待克服。首先，必须区分老鼠模型和人类模型之间的差异，尽管它们之间有很大的相似之处，但小鼠的实验条件与人类疾病不同。NAFLD 和NASH 的分子机制中仍有许多问题值得探讨，通过进一步研究，巨噬细胞有望成为治疗NAFLD 和NASH 的新靶点。