注射用肉毒毒素制剂及其研发进展

屈见闻，潘 博，赵雪莲

（1.中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院整形七科，北京，100144；2.河北医科大学第二医院整形外科，石家庄 河北，050000）

自1979年Scott[1]首次将A型肉毒毒素应用于矫正眼外肌失衡作为斜视手术的替代方法以来，注射肉毒毒素已成为各种局灶性肌张力障碍的治疗选择。1987年，加拿大眼科医生Jean Carruthers在注射肉毒毒素治疗眼睑痉挛时，偶然发现眉间纹消失了。她和她的丈夫皮肤科医生Alastair Carruthers于1996年发表了一份关于肉毒毒素在美容中应用的报告[2]。1992年，Schantz和Scott公布了A型肉毒毒素治疗皱纹的用途。自那以后，开启了肉毒毒素在美容整形领域的开创性治疗，包括消除额肌纹、鱼尾纹、颈阔肌纹、提眉、治疗咬肌肥大、改善面部轮廓、腿部塑形等[3-5]。肉毒毒素注射已成为中国最受欢迎的美容手段之一，本文概述了注射用肉毒毒素的作用机制，目前美国和中国上市肉毒毒素制剂，以及肉毒毒素制剂的研发进展。

1 肉毒毒素的作用机制

肉毒毒素是由肉毒杆菌(Clostridium botulinum)分泌的神经毒素、外毒素，共有A-G七种血清型，尽管各种类型毒素的氨基酸序列和免疫性存在差异，但它们均显示出相似的分子结构。在细胞水平上，细菌分泌的毒素复合物包括肉毒毒素分子和非毒素蛋白（血凝素蛋白和非血凝素蛋白）。其中非毒素蛋白可以稳定复合物中的毒素分子，同时防止其吸收时被消化酸变性[6]。事实上，复合物中起主要作用的是约150kDa无活性的单链多肽，其进入机体后被活化成分子量为100kDa重链(High chain,HC)和50kDa的轻链(Light chain,LC)，两者通过二硫键、非共价相互作用以及由重链N端组成的独特片段围绕球形的轻链结构域相连接[7]。

最新研究表明，肉毒毒素作用机制大致分为5个过程[8]：①结合：通过消化道吸收或者局部注射的肉毒毒素进入血液循环后，迅速来到神经末梢突触间隙，依靠H链的C端，与神经节苷脂受体和突触小泡腔中的受体结合[9]；②内吞：毒素通过内吞作用形成突触小泡进入神经末梢；③移位：内吞体内pH下降，毒素变构，借助重链的N端在内吞体膜形成通道，将轻链结构域转运至胞浆，此时依然通过二硫键保持连接[10]；④释放：在硫氧还原蛋白还原酶-硫氧还原蛋白系统(Thioredoxin reductase-thioredoxin system,TrxR-Trx)作用下，两条链分离，释放轻链至胞浆[11]；⑤裂解：轻链裂解可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE蛋白)，阻碍乙酰胆碱胞吐的发生。轻链为一种Zn2+依赖性的蛋白内切酶，可以裂解囊泡与质膜融合过程中关键的三种SNARE蛋白，即突触融合蛋白(Syntaxin)、SNAP-25(Synaptosomal-associated protein of 25kDa)和突触囊泡蛋白(Synaptobrevin/VAMP)，导致乙酰胆碱释放障碍，从而引起神经麻痹[12]。因此，微小剂量的肉毒毒素能够治疗由功能亢进的神经末梢引起的疾病。

肉毒毒素在靶肌肉中的作用随着时间的推移而减弱，神经和肌肉之间的信号传导会逐渐恢复。事实上，目前尚不清楚毒素是如何从神经末梢代谢或以何种方式被清除的，对于毒素的吸收、分布、代谢和消除机制的认识仍没有完全掌握。有学者认为，毒素不可逆地与突触末梢结合后，这种蛋白会逐渐被人体降解，功能轻链从神经终板清除[13]，从而失去疗效。亦有人认为，SNAP-25再生或终板旁生新芽形成新的神经联接[14,15]，使神经肌肉的信号传导和肌肉收缩力得以恢复。文献回顾发现，肉毒毒素用于面部除皱治疗的持续时间大多数为3至4个月，偶尔也可达到6个月[16]。为达到理想治疗效果，患者一年内需多次注射以保持一定程度的改善，不仅增加治疗费用，也减弱了其便捷性。因此，科学家们在不断探索持续时间更长、效果更佳、安全性更高的新型肉毒素。

随着BoNT/A适应症进一步扩大，制剂的抗原性问题变得越来越重要。关于BoNT/A诱导的免疫原性问题备受争议，然而，已经有许多治疗失败的报道和BoNT/A诱导的中和抗体的观察[17]。研究发现，毒素复合物中的蛋白如血凝素可作为佐剂，增加机体对制剂注射的免疫反应。例如，血凝素-33是一种高度免疫反应性的神经毒素相关蛋白，可激活树突细胞启动免疫反应[18]，去除血凝素-33可最大限度地降低免疫原性。抗体的形成是一个令人担忧的问题，这可能导致随着时间的推移疗效下降，甚至治疗无反应[19]。据报道，长期使用A型肉毒毒素治疗超过10年以上的患者，体内产生中和抗体的发病率高达13.9%[20]。若患者对毒素复合物形成中和抗体后，再次注射时需要使用更大量的毒素才能达到同样的疗效，这种情况必须更加谨慎注射，以防大量毒素释放入血引起肉毒毒素中毒[21]。

2 美国和中国上市的注射用肉毒毒素制剂

用于医学治疗的肉毒毒素主要为A型和B型，A型作用持续时间更长，而B型起效时间更快。目前，美国食品药品监督管理局(FDA)批准4种在售的肉毒毒素制剂，包括3种A型肉毒毒素OnabotulinumtoxinA,IncobotulinumtoxinA,AbobotulinumtoxinA和1种B型肉毒毒素RimabotulinumtoxinB。中国国家药品监督管理局(NMPA)批准上市的是OnabotulinumtoxinA，CBTX-A，以及2020年批准的AbobotulinumtoxinA和韩国Hugel公司生产的注射用A型肉毒毒素。

2.1 OnabotulinumtoxinA (Botox;Allergan,Inc.,Irvine,CA,USA)

Botox，中文名为保妥适，是一种无菌、冻干粉形式的A型肉毒毒素。主要用于治疗眼睑痉挛、面肌痉挛及相关局灶性肌张力障碍，同时也可以暂时改善成人中度至重度的眉间纹。Botox由C botulinum细菌的Hall株产生，并在含有N-Z胺和酵母提取物的特定培养基中培养。共有每瓶50U，100U和200U三种规格，每100U中包含0.5 mg的人血白蛋白和0.9 mg的氯化钠。最初，由于担心毒素的热稳定性，在复原之前将药瓶保存在冰箱中。但是证据表明，在使用前可以在冷藏温度下安全存放至少36个月[22]。

2.2 AbobotulinumtoxinA (Dysport;Ipsen Limited,Slough Berkshire,UK)[23]

Dysport，中文名为吉适，是美国FDA在2009年批准的第二种神经调节剂[24]，于2020年中国获批。自1990年以来，该制剂已在70多个国家/地区成功使用[25]。Dysport有300U和500U两种规格，每500U中包含0.125 mg人血白蛋白和2.5 mg乳糖。Dysport与Botox在单位、化学性质、生物活性、重量等方面都不同。因此，这两种剂型不具有互换性，给药也不能基于单一的转化率。最近证据表明Dysport:Botox接近2.5:1对治疗除皱有效[26]。与所有神经毒素一样，总体建议是使用毒素的量与肌肉肥大的程度相匹配，以达到预期效果。

2.3 IncobotulinumtoxinA (Xeomin;Merz Pharmaceuticals GmbH,Frankfurt,Germany)[27]

Xeomin是于2011年获得FDA的批准A型神经毒素，用于治疗慢性流涎、上肢痉挛、颈部肌张力障碍、眼睑痉挛和眉间纹。共有50U和100U两种规格，每100U中包含1 mg人血白蛋白和4.7mg蔗糖。Xeomin的纯化过程将毒素从复合蛋白中分离出来，最终得到仅含有150 kDa活性成分的冻干产品[28]。因此，理论上它的免疫原性较小，降低了中和抗体产生的风险[29]。如果疗程中需要注射大剂量肉毒毒素时，Xeomin具有一定优势。

2.4 RimabotulinumtoxinB (Myobloc/NeuroBloc;Solstice Neurosciences Inc.,CA,USA)[30]

Myobloc是美国目前唯一可用的B型肉毒毒素。临床应用几乎仅限于神经肌肉疾病，包括颈部肌张力障碍，不过它已经成功地用于说明书注明以外的面部动态皱纹治疗[31]。Myobloc是一种非冻干和稳定的液体制剂，规格有2500U/0.5mL，5000U/mL和10000U/2mL，其中每2500U/0.5mL中包含0.235mg人血白蛋白、2.9mg氯化钠和1.35mg琥珀酸钠。与疗效可以持续3至4个月的A型肉毒毒素相比，Myobloc起效更快，但作用持续时间更短（约2个月）[32]，而且由于溶液的酸碱度呈酸性，注射时可能会引起疼痛，有一定的不适感。Myobloc与A型肉毒毒素无交叉反应，可有效地用于接受大剂量毒素且对A型肉毒素无反应或产生中和抗体的患者[33]。

2.5 CBTX-A (Prosigne/Lantox/Redux;Lanzhou Biological Products Institute,Lanzhou,China)

CBTX-A，商品名为衡力，是由中国兰州生物制品研究所生产，活性成分为A型肉毒结晶毒素，生产用菌种为产毒力高的A型肉毒梭菌Hall株。每瓶含A型肉毒毒素50U或100U，辅料为蔗糖、右旋糖苷、明胶。相对于同体人血白蛋白，明胶为异体蛋白，需警惕过敏反应。CBTX-A主要用于治疗眼睑痉挛，面肌痉挛等成人患者及某些斜视，特别是急性麻痹性斜视，对于改善眉间纹也有一定的疗效[34]。CBTX-A在≤8 ℃条件下可以保存3年，在室温保存期限为6个月，药品复溶后在2～8 ℃无菌条件可保存6天[35]。

2.6 LetibotulinumtoxinA (Botulax/Letybo;Hugel Inc.,Gangwon-do,Republic of Korea)

Letybo，中文名称为乐提葆，韩国生物制药公司Hugel生产的注射用A行肉毒毒素，于2020年获得中国批准。生产菌种为肉毒梭菌CBFC26[36]，有效成分为900kDa肉毒毒素，赋形剂为氯化钠和人血白蛋白，规格为100U/瓶，储存条件在2-8℃。目前主要用于治疗成人原发性眼睑痉挛，中风后上肢痉挛，2岁以上脑瘫患儿动态马蹄足畸形，以及暂时改善与皱眉肌相关的皱纹，和成年人眼轮匝肌活动相关的眼部皱纹[37]。

虽然不同形式的肉毒毒素显示出相似的效果，但每种产品都有独特的制造工艺、赋形剂、配方等，且每种神经调节剂都有一条非平行的剂量-反应曲线，这意味着它们的相对性能在一系列剂量比范围内并不一致[38]。因此，它们并不具有生物同一性。一种给定单位的毒素剂量与另一种毒素的转化并非恒定的。临床医生必须彻底了解每种产品的特性和临床性能，充分考虑患者的个性化需求，结合治疗区域和适当剂量，以实现安全有效地使用。

3 研发进展

3.1 新型制剂

多数具有药理作用的蛋白质具有粘附于固体表面的特性，在将其注入容器中时，部分蛋白质会粘附于容器内壁而造成活性成分的损失。同时，蛋白质易被氧化或被降解成小片段。因此商品化肉毒毒素制剂除包含纯毒素分子或毒素复合物外，还添加了一种或多种赋形剂，如蛋白、离子化合物、糖等。蛋白主要指人血清白蛋白或明胶。然而，它们是动物来源的蛋白质，有携带血液中病原体而引发感染的风险。部分患者可能会对其产生变态反应，在重复注射后引起过敏[39]。

DaxibotulinumtoxinA for injection (DAXI/RT002,Revance Therapeutics,Inc,Newark,CA)，一款新研发的注射用A型肉毒素，不含人血白蛋白，避免了上述不良反应的产生。其主要成分为纯化的150 kDa神经毒素，与冻干粉中的专利肽一起配制[40]。该肽具有带正电荷的赖氨酸主链，可以与负电荷的核心神经毒素静电结合，并允许在没有人血清白蛋白的情况下配制DAXI，且保证其重构前的稳定性和作用效果[41]。此外，已证明该肽可提供高亲和结合力，从而限制了注射后肉毒毒素的扩散，表现出更长的作用持续时间。对小鼠腓肠肌分别注射DAXI和Botox后测定肌肉麻痹结果显示，两者具有相同效力，且相邻胫骨前肌的肌肉麻痹结果表明DAXI的扩散明显较少。当使用既定剂量分别注射两种制剂时，DAXI的作用持续时间可延长58%至100%[42]。此前人们认为，毒素复合物的分子大小决定了它在组织中的扩散能力，然而实验研究表明，扩散系数与毒素复合物的大小无关[43]。目前已开展了使用DAXI治疗眉间纹的1-3期临床试验[44-46]，结果显示注射40U DAXI患者耐受性好，且具有最有利的风险-效益比，与20U Botox相比，表现出更高的应答率和更长的应答持续时间[47]。同时，DAXI治疗皱纹严重程度恢复至基线的中位时间≥24周[48]。因此，其极有可能成为持续时间为6个月甚至更久的长效注射用A型肉毒毒素。

3.2 液体组合制剂

肉毒毒素分离的过程由一系列酸制剂产生，形成由活性毒素和血凝素蛋白组成的结晶复合体。然后将该制剂重新溶解在盐水和蛋白中，消毒真空干燥，以冻干粉形式保存及运输。冻干或冷冻干燥的过程，是指先将物质冻结，然后降低周围压力，使冻结凝固的水升华为气相，这种方法可以最大限度降低由高温引起的蛋白质变性风险。然而通过冻干等方式制备的干粉制品，需要在使用前进行重新溶解，使用时不方便。为了保证作用效果，需要仔细配制准确的浓度，溶解过程中存在稀释造成毒素量的偏差。Botox制造商Allergan建议将不含防腐剂的生理盐水缓慢注射到制剂小瓶中，通过缓慢旋转小瓶将肉毒毒素与盐水混合，避免剧烈搅拌，溶解后需保存在2℃至8℃之间，且24小时内使用[22]。有些人认为，泡沫的形成和剧烈搅拌可能会使肉毒毒素溶液易受气泡引起的表面变性，或气泡可能会导致毒素分散在小瓶表面从而影响疗效。此外，稀释过程可能会导致污染[49]。因此，对能够改善便利性无需重新溶解，且能够保证毒素稳定有效的液体组合制剂的需求不断增长。研究者通过将一些赋形剂，如离子化合物、糖、聚山梨酯、糖醇等与毒素按不同比例组合，可以增强制剂的热稳定性，增加溶解度，还可以减少聚集程度，在液态下稳定毒素分子并防止其变性。不仅可在常温以上的高温下维持肉毒毒素的活性，还可以维持长期的贮存稳定性。

3.3 工程化肉毒毒素

目前，市售肉毒毒素均通过培养天然肉毒杆菌，随后进行一系列分离和纯化毒素复合体来生产的，这种方式过程复杂且蛋白产量低。在下一代测序和重组技术的时代，基因工程重组蛋白的生产达到了新高度。通过将BoNT的DNA编码部分（开放阅读框）整合到大肠杆菌或其他微生物中，带有BoNT开放阅读框的微生物随后产生毒素蛋白[43]。大肠杆菌表达系统允许使用简单的培养基，从而实现大规模生产。生物安全风险也没有培养肉毒杆菌大，因为用于异源表达的大肠杆菌菌株没有致病性。这将为BoNT及其他神经毒素的转基因提供一个标准化和更安全的生产过程[50]。事实上，构建全功能重组BoNT绝非易事，其中一个重要因素是成熟蛋白的双链结构。如前所述，虽然最终发挥毒素效应的是轻链，单链BoNT蛋白也能够进入神经元并在一定程度上抑制囊泡释放，但它们的效力较低。此外，在不存在重链的情况下，分离的轻链在水溶液中难以溶解，且易受到蛋白水解酶降解。可见，双链的二肽形式是BoNT发挥完全神经毒素所必需的[51]。这就要求保留连接两条链的二硫键、结构域，同时保证两者之间正确的折叠。因此，在体外单独表达并将纯化的重链和轻链生产活性双链的过程是一项重大挑战。

3.4 透皮给药

目前临床上使用的肉毒毒素制剂均为注射给药，然而注射伴随一些副作用，例如注射部位的刺激、炎症、感染、出血等。对于多汗症等情况，可能需要在敏感部位（如手掌或腋窝）进行多次皮下注射，导致患者不适甚至疼痛。透皮给药系统 (Transdermal drug delivery system,TDDS)作为一种非侵入性治疗方法，通过在皮肤表面给药，使药物以近似恒定的速率进入皮肤，产生全身或局部治疗效果，具有良好的顺应性及非创伤给药的特点，成为目前研发的重点。从凝胶、乳膏、软膏到即用型贴剂，增加了便利性，并减少了注射造成的不适。但由于生物屏障的限制及毒素分子量过大，难以透过皮肤，故需借助载体或外界设备透过皮肤屏障。目前正在开发的无针法递送药物的范围相对浅表，尚不能替代那些涉及到使用BoNT治疗深层肌肉运动障碍的注射方法。此外，这种方法缺乏靶向性，存在进入任何细胞的可能，会增加非特异性毒性的风险。

3.4.1 细胞穿透肽(Cell Penetrating Peptides,CPPs)

CPPs主要指来源于不同生物的短肽，具有共价或非共价附着到大分子（包括肽、蛋白质、核酸等）上的能力，并携带它们穿过细胞膜，而不发生任何构象变化[52]。常见的CPPs有HIV-TAT的多肽片段、触角足突变(Antennapedia)。活细胞摄取CPPs的确切机制仍不清楚，目前推测与能量无关的细胞膜“直接转运”和能量依赖的“胞吞作用介导的易位”有关[53]。Saffarian等[54]通过将BoNT/A轻链与TAT肽共价连接，构建了一种重组蛋白TAT-BoNT/A(1-448)。用BoNT/A轻链代替全蛋白来降低最终分子大小，增加了皮肤吸收的可能性。通过在小鼠皮肤表面上局部施用含TAT-BoNT/A溶液，免疫组织化学数据显示30分钟后观察到了蛋白渗透的迹象，同时细胞内蛋白水平随着时间的推移而增加。高效液相色谱分析表明，这种重组蛋白的生物活性是BoNT/A(1-448)蛋白的1.5倍。因此，他们认为TAT-BoNT/A具有生物活性，与作为对照的BoNT/A(1-448)相比，可以在体外和体内成功地通过活细胞传递，且更有效。Revance公司正在开发一种外用产品RT001（A型肉毒毒素凝胶）[55]，由纯化的150kDa BoNT/A蛋白组成，配制在含有基于CPP的渗透增强肽赋形剂RTP004的泊洛沙姆(Poloxamer)凝胶中。随后，开展了一系列2期研究证明RT001在治疗中度至重度外侧鱼尾纹或多汗症方面是安全有效的[56]。2015年，Revance宣布已开始在一项3期关键研究中对患者进行给药，以评估RT001治疗外侧鱼尾纹的安全性和有效性。然而该研究未达到其共同主要终点，因此停止了进一步的开发计划[57]。

3.4.2 纳米技术

许多机构正在研发出能够帮助大分子和小分子药物渗透到完整皮肤中的纳米粒子。Chajchir等[58]报道了一种BoNT/A乳霜制剂(CosmeTox)，每毫升含有2U BoNT/A。这种新的药物递送方法基于小于1-10nm的混合胶束离子纳米粒子技术(Ionic nanoparticle technology,InParT)，该技术将活性分子封装在载体中，以增加其在皮肤中的生物利用度。Chajchir等希望将其用于治疗那些害怕针头和不想注射的人，或那些想延长肉毒毒素注射效果的人，在注射治疗后长期使用这种乳膏作为维持治疗，以减缓皱纹再次形成的过程。他们随机选择了40名女性受试者，每天晚上在面部、下巴和颈部外用CosmeTox或安慰剂霜，连续使用4-7周。使用CosmeTox的受试者整个过程总计外用BoNT/A可达50-70U。根据患者报告的面部线条结果评分问卷结果显示，CosmeTox可以显著改善面部特征和年龄外观。然而由于使用固定的BoNT/A剂量非常低，这一结果令人惊讶，而且试验结果是根据患者主观感受填写问卷，制剂的真实疗效还有待进一步验证。

3.4.3 借助外界设备

当含有小分子的液体置于弱电流下时，分子可获得容易穿透完整皮肤表面的能力，这种技术称为离子电渗疗法(Iontophoresis)。通过这种方法，许多具有小分子、表面极性和适当水溶性的药物可以安全无痛地输送到皮肤中。BoNT/A为负电荷水溶性药物，满足离子导入的条件。Kavanagh等[59]利用离子电渗装置(Iomed Phoresor II) 辅助BoNT/A透过皮肤，对这两名严重手多汗症患者进行治疗。当用淀粉碘试验进行测试时，治疗结果令人满意，甚至接近于注射型肉毒毒素(约70%)，证明了离子电渗确实可以成功地输送肉毒毒素。然而，存在一些限制，包括该方法中使用的设备成本相对较高，长期和高频率的治疗周期增加了最终成本，另一方面，增加了皮肤过敏的可能性[60]。

经皮气动喷射(Transcutaneous pneumatic injection,TPI)是指根据治疗目的调节渗透压力和溶液体积，将特定溶液微创但强力地输送到皮肤中。Kim等[61]报告了一种利用压力和剂量控制、无针、经皮气动喷射法治疗腋窝和掌跖多汗症。在局部应用麻醉乳膏后，使用TPI装置(Shemax™;Shenb Co.,Ltd)在2.05巴（压强单位）下以0.08mL/shot将含有BoNT/A溶液喷射至治疗区域，通过淀粉碘测试结果和多汗症疾病严重程度量表评分来评估其功效。研究表明低浓度BoNT/A可以有效且安全地治疗了腋窝和掌跖多汗症，利用二维超声发现BoNT/A在腋窝和掌跖皮肤的整个真皮和真皮-皮肤脂肪连接处产生了界限分明的浸润区。然而，这项研究参与者少，随访时间短，缺乏对照组，并且没有评估出汗的客观指标。因此，需要在更大的人群中进一步证实其安全性和有效性。此外，没有可靠的组织学证据证明BoNT/A在喷射后渗透到活的皮肤组织内。考虑到BoNT/A全蛋白的大尺寸(150kDa)，它不太可能通过具有选择性渗透性的皮肤细胞膜，如果正如作者所述，应该进一步解释和探究BoNT/A进入皮肤的分子机制。

此外，也有将低频超声、X射线、核磁共振等与BoNT透皮给药相结合[62]，这些方法将进一步扩大肉毒毒素在医学美容领域的应用。

4 结论

肉毒毒素的使用为许多疾病提供了替代治疗方案，也为整形美容行业带来了巨大改变。市场上各类产品由于其不同的生产过程和条件，在单位、化学性质、生物活性和重量方面有所不同，因此不可简单地互换。为了安全的临床实践，并获得最佳疗效，从业者必须彻底了解每种制剂的特性、规格、转化率和安全性（毒素扩散和免疫原性）等临床问题。此外，各大机构也在加快研发新兴产品，新型制剂展现出巨大潜能，如提供更长的持续时间、更优的治疗效果、更少的不良反应，甚至是更多样化的给药途径。虽要抛弃新鲜事物“猛于虎”的思想，也应对其临床应用的可行性进行全面地评价。随着对毒素作用机制的更好理解和生物技术的进步，相信未来的产品会为患者提供更多的选择。