褐飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建及PIGM互作蛋白的筛选

郑荣儿,吴佳敏,张瑞娟,姬金亮,李雅彬,俞晓平,许益鹏

(中国计量大学 生命科学学院 浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室,浙江 杭州 310018)

褐飞虱Nilaparvatalugens(Stål)(Hemiptera: Delphacidae),是一种在我国和东南亚地区的农业害虫之一,以水稻韧皮部为食,爆发时会对水稻造成巨大的危害,在农业上防治较为困难[1]。目前,基于基因功能的研究,利用RNA干扰等分子生物学技术防治褐飞虱已经成为一种新兴的防治方法[2]。PIGM,编码糖基磷脂酰肌醇(GPI)甘露糖基转移酶I,在GPI锚蛋白的生物合成途径中负责将第一个甘露糖从多利醇-磷酸-甘露糖转移到内质网网腔侧的前体上,对于GPI锚蛋白的合成具有至关重要的作用[3]。PIGM亚纯启动子的突变将阻断GPI的转录,从而导致遗传性糖基磷脂酰肌醇的缺乏,引起静脉血栓的形成和癫痫的发作[4]。目前,关于PIGM的研究都集中在哺乳动物或原生动物中,在昆虫中未见相关的报道。我们前期发现,褐飞虱PIGM(NlPIGM)在卵巢中特异性高表达,并通过功能研究证明NlPIGM在褐飞虱的生殖发育中具有重要的调控作用,RNA干扰NlPIGM的表达会导致褐飞虱雌成虫卵巢发育延滞、产卵量下降、胚胎发育畸形,但其具体的作用机制不明。因此,进一步研究PIGM在褐飞虱中的作用机制对于利用PIGM作为褐飞虱防治靶标有着重要意义。

酵母双杂交是一种在筛选潜在互作蛋白和研究蛋白之间相互作用方面被广泛应用的生物技术。Chi等[5]构建了烟粉虱Bemisiatabaci的cDNA文库并从中筛选了54个可能与棉花曲叶病毒外壳蛋白相互作用的候选蛋白;Yu等[6]通过酵母双杂交证明家蚕BombyxmoriSpz2通过与Toll 11和Toll 9-1相互作用而诱导抗菌肽的表达;Du等[7]通过酵母双杂交发现中红侧沟茧蜂Microplitismediator中的GAP1蛋白能够与棉铃虫Helicoverpaarmigera的RhoA和Cdc42相互作用以抑制宿主的免疫反应,从而提高寄生成功的可能性;Guo等[8]构建了真菌感染后的小麦cDNA文库,筛选和验证了小麦热休克蛋白Hsp70与HSF A9L和Hsp90-4存在相互作用,为阐明小麦HSP对真菌感染的反应机制提供了依据。酵母双杂交技术也已广泛成为研究稻飞虱在植物-宿主互作和病毒-宿主互作等方面的一种技术[9-11]。如Huang等[10]通过酵母双杂交系统构建的cDNA文库鉴定了一个与褐飞虱寡霉素敏感相关蛋白相互作用的水稻齿叶矮缩病毒非结构蛋白Pns10;Qin等[12]则通过酵母双杂交实验确定了灰飞虱中肠上皮糖转运蛋白6(ST6)与水稻条纹病毒核衣壳蛋白的相互作用,确定了ST6是水稻条纹病毒跨越中肠感染屏障的关键因子。

本研究通过构建褐飞虱cDNA文库和诱饵载体pGBKT7-NlPIGM,利用酵母双杂交系统从褐飞虱cDNA文库中筛选与NlPIGM具有潜在相互作用的蛋白,以进一步探究NlPIGM的作用机制。

1 主要材料与方法

1.1 主要材料

供试褐飞虱长期饲养于中国计量大学温网室与人工气候室中,饲养温度27 ℃±1 ℃,相对湿度为60%,光周期L∶D=16 h∶8 h,饲养所用水稻品种为TaichungNative1(TN1)。

主要试剂:RNA提取试剂盒(TaKaRa,AK1703)、反转录试剂盒(TaKaRa,AK71648A)、DNA割胶回收试剂盒(TaKaRa,AI51866A)、限制性内切酶NcoⅠ(TaKaRa,AJE1364A)和SalⅠ(TaKaRa,AJ11106A)、T4连接酶(TaKaRa,AI60350A),质粒小量提取试剂盒(上海生工生物工程,BB12KA1530)、Trizol(Invitrogen,14105),Oligotex mRNA Midi Kit(Qiagen),JM109大肠杆菌感受态(TaKaRa,AK51792A)、pMD19T(TaKaRa,K4001AA)、pGBKT7和pGADT7载体以及Y2H Gold酵母菌株保存于本实验室。

主要仪器:金属浴锅(K30,杭州奥盛仪器有限公司)、超净工作台(SW-CJ-ZP,浙江苏净净化设备有限公司)、恒温培养箱(HPX-9272-MBE,上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、摇床(ULT2186-4-V49)、PCR仪(T100,Bio-Rad)、凝胶成像仪等(Universal Hood Ⅱ,Bio-Rad)。

1.2 主要方法

1.2.1 褐飞虱总RNA的提取及mRNA的纯化

取发育至3～5日龄的褐飞虱雌成虫,用0.5 mmol/L的PBS冲洗数次后转移至预冷的研钵中,液氮研磨后转移至无RNase的离心管中,使用Trizol法提取褐飞虱的总RNA。随后,使用Oligotex mRNA Midi Kit对mRNA进行分离纯化(分离步骤参照试剂盒使用说明书)。然后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量,并使用cDNA合成试剂盒将mRNA反转录成cDNA。

1.2.2 cDNA文库的构建

褐飞虱cDNA初级文库的构建通过CloneMiner cDNA文库构建试剂盒进行。合成双链cDNA后,将attB1连接到双链cDNA末端,试剂和实验方法如下:将10 μL 5× Adapter Buffer,4 μLattB1 Adapter,8 μL 0.1 M DTT,6 μL T4 DNA Ligase混匀,在16 ℃孵育16～24 h;70 ℃,10 h。然后使用柱层析法将cDNA产物分离、沉淀、清洗、溶解后,加入2 μL pDONR222质粒,通过BP重组反应链接载体。

电转化大肠杆菌DH10B:在重组反应液中加入2 μL proteinase K,37 ℃ 15 min,75 ℃ 10 min。加入大肠杆菌DH10B后冰浴10 min,然后转移到电击杯中电转化,转化条件:1.5 kV,200 Ω,25 Mf。电转化完成后加入4 mL SOC液体培养基,37 ℃,250 r/min摇床1 h,然后取10 μL菌液,稀释100倍,取50 μL稀释后的菌液涂布于Amp抗性的LB培养基上,37 ℃过夜培养后用于计算文库滴度和库容量。用LB液体培养基收集其余菌液涂平板所得的菌体,其余菌液涂布于Amp抗性的LB平板,过夜,用使用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒,得到初级cDNA文库。

次级cDNA文库构建:将提取到的初级cDNA文库质粒稀释到300 ng/μL,加入1 μL pGADT7-DEST(300 ng/μL),4 μL LR Clonase,14 μL ddH2O,混匀,25 ℃,孵育16～20 h。然后电转化于DH10B感受态细胞,涂布于Amp抗性的LB平板上,鉴定库容和滴度,提取次级文库cDNA质粒,保存。

次级cDNA文库转化Y187酵母菌株:简单来说,就是将5 μL次级文库cDNA质粒,20 μL ssDNA和600 μL Y187酵母感受态细胞混匀,然后使用PEG/LiAC转化法将质粒转化至Y187酵母感受态细胞,鉴定库容和滴度,获得褐飞虱cDNA文库。

1.2.3 文库质量和滴度的测定

将转化完成的次级文库菌液分别稀释100倍,1 000倍和10 000倍,各取100 μL涂布于SD-Leu平板上,计算菌落生成数量。文库滴度的计算方法如下:文库滴度=单菌落数×稀释倍数/涂布菌液体积(mL)。

原始库容量(CFU)计算方法如下:CFU=文库滴度×文库体积(mL)。

将cDNA文库质粒转化至Y187酵母菌株后,取100 μL均匀涂布于Amp抗性的LB培养基上,随机挑选24个平板上的单克隆,利用pGADT7通用引物(表1)对其进行PCR检测,计算文库重组率。重组率计算方法如下:重组率=(阳性插入片段的克隆数/反应总数)×100%。

1.2.4 两步法构建pGBKT7-NlPIGM重组诱饵载体

以设计的BD-NlPIGM-F/R引物(表1),褐飞虱的cDNA为模板,扩增NlPIGM,产物电泳鉴定后回收,与pMD19T进行16 ℃过夜连接。将连接产物转化到JM109大肠杆菌感受态细胞中,取200 μL菌液,涂布于Amp抗性的LB平板上,37 ℃过夜培养。次日挑取单个菌落,在含有Amp抗性LB培养基的离心管中培养(37 ℃,180 r/min),取菌液送上海生工生物工程有限公司测序。挑选转化成功的转化子,抽提质粒。将鉴定后的重组质粒命名为pMD19T-NlPIGM。然后将pMD19T-NlPIGM质粒和pGBKT7空载体分别使用NcoⅠ和SalⅠ限制性内切酶进行双酶切,将割胶回收后的pMD19T-NlPIGM质粒的目的片段和pGBKT7质粒的载体片段用T4连接酶连接,转化到大肠杆菌JM109感受态中,挑取转化子摇床振荡培养(37 ℃,180 r/min),用NcoⅠ和SalⅠ限制性内切酶进行双酶切鉴定,测序,鉴定无误的转化子抽提质粒,命名为pGBKT7-NlPIGM,保存备用。

表1 用于本研究的引物序列

1.2.5 重组诱饵质粒转化Y2H gold酵母菌株

通过PEG/LiAc转化法,将pGBKT7空载体及pGBKT7-NlPIGM载体分别转化到Y2H Gold酵母菌株中。先将Y2H Gold在YPDA固体培养基上划线,于30 ℃培养2～3 d,取1.5 mL离心管,加入1 mL 0.1 mol/L LiAc,挑取单菌落于离心管中重悬,30 ℃,180 r/min振荡摇床5 min,离心收集菌体。依次加入50% PEG-3350 240 μL,1 mol/L LiAc 36 μL,95 ℃金属浴5 min,然后冰上放置1 min预处理的ssDNA 0.1 μg,质粒DNA 5 μL,ddH2O 20 μL,漩涡振荡,42 ℃金属浴20 min,离心,取上清,加入ddH2O 100 μL。取稀释10倍,100倍的菌液分别涂布于SD-Trp培养基上,30 ℃封口倒置培养3～5 d,出现单菌落以后,划线一次,然后进行菌落PCR验证,成功转化的菌株保存于-80 ℃冰箱。

1.2.6 诱饵重组质粒的自激活活性及其毒性鉴定

1)重组诱饵质粒的自激活活性鉴定:挑选成功转化的重组诱饵菌接种到SD-Trp,SD-trp/X-α-gal,SD-trp/X-α-gal/AbA培养基中,37 ℃封口倒置培养1 d,观察生长情况,pGBKT7空载体作为对照组。

2)重组诱饵质粒的毒性鉴定:将pGBKT7-NlPIGM重组载体转化至大肠杆菌Y2H Gold感受态细胞,取稀释10倍和100倍的菌液100 μL接种在SD-Trp培养基,37 ℃培养,观察其生长情况。转化pGBKT7空载体的菌株作为对照组。

1.2.7 酵母双杂交筛选潜在互作蛋白

通过mating法筛选双杂交文库,将在SD-trp-Leu-His-Ade/X-α-gal/ABA平板上变蓝的杂交克隆送测序,然后通过NCBI数据库进行Blastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对,并分析可能具有相互作用的蛋白功能。

2 结果与分析

2.1 褐飞虱总RNA提取及mRNA电泳验证

从褐飞虱中提取总RNA,测定其RNA OD260/OD280为2.13,电泳检测发现28S rRNA和18S rRNA条带清晰,明亮,亮度比例接近2∶1(图1A),说明提取的总RNA未发生降解,完整性较好。mRNA纯化后经电泳检测发现条带成弥散状分布,质量较高(图1B)。

注:A—提取的总RNA电泳;B—纯化的mRNA电泳;M—DL 2000 Marker图1 总RNA(A)和纯化的mRNA(B)电泳图Figure 1 Electrophoresis of total RNA(A) and purified mRNA(B)

2.2 cDNA文库的质量和滴度鉴定

将合成的cDNA经过BP重组获得初级cDNA文库,统计稀释了100倍的SD-Leu平板上的菌落数量为1 300,通过文库滴度计算公式得初级文库滴度为2.6×107CFU/mL,初级文库库容量为1.04×108CFU。平板上挑选的随机克隆经PCR鉴定,发现插入片段范围集中在750～2 000 bp,没有发现空载体,计算重组率为100%(图2A),说明初级cDNA文库质量的完整性和覆盖性较好。

将初级文库质粒通过LR重组反应得到次级文库,涂布于Amp抗性的平板上,统计发现稀释了100倍的平板上克隆数目为1 700,通过公式计算得到次级文库的滴度为3.4×107CFU/mL,次级文库库容量为1.36×108CFU,在平板上随机挑选的24个克隆经PCR鉴定后,发现插入片段范围集中在750～2 000 bp,没有发现空载体,计算重组率为100%(图2B)。

另外将次级文库转化Y187酵母菌株,统计发现稀释10 000倍的平板有600个克隆,计算文库滴度为6.0×107CFU/mL。随机挑取克隆,PCR检测后,得到不同大小的条带,且条带大小集中于750～2 000 bp附近(图2C),表明成功构建褐飞虱cDNA酵母文库,且文库的质量较好,可以用于酵母双杂交实验。

注:A—初级文库PCR鉴定;B—次级文库PCR鉴定;C—Y187酵母菌株PCR鉴定;M—DL 2000 Marker;1～24—随机挑选的克隆图2 cDNA文库插入片段的电泳检测图Figure 2 Electrophoresis identification of inserts in the cDNA library

2.3 诱饵重组载体(pGBKT7-NlPIGM)的鉴定

为了准确测定那西肽预混剂中那西肽的含量，参考饲料中那西肽的检测方法[11]，研究了高效液相色谱-荧光检测法测定那西肽预混剂含量的方法，方法操作简便，灵敏度高，对建立的方法与抗生素微生物检定法进行比较，以期为兽药质量标准提供新的选择。

将NlPIGM与pGBKT7载体连接,然后用NcoⅠ和SalⅠ限制性内切酶对pGBKT7-NlPIGM载体进行双酶切鉴定,鉴定结果显示产物双酶切后条带大小与预期一致(图3),且测序结果显示序列正确,表明成功构建了pGBKT7-NlPIGM重组载体。

此外,将诱饵重组载体pGBKT7-NlPIGM转化至Y2H Gold酵母菌株中,涂布,然后通过菌液PCR扩增NlPIGM鉴定载体转化情况。结果发现菌液PCR条带明亮、大小与预期一致(图4),说明成功构建了pGBKT7-NlPIGM诱饵重组载体的Y2H Gold菌株。

注:M1—DL 2000 Marker;M2—DL 10000 Marker;1～2—用于酶切的2个重组载体图3 重组诱饵载体双酶切验证图Figure 3 Verification of recombinant bait vector digested with double restriction enzymes

注:M—DL 2000 Marker;1～5—随机挑选的5个克隆图4 Y2H Gold菌株菌落PCR电泳鉴定图Figure 4 Colony PCR electrophoresis identification of Y2H Gold strain

2.4 诱饵重组载体的自激活和毒性检测

将转化了pGBKT7空载体的菌株接种到SD-trp培养基上,将pGBKT7-NlPIGM诱饵重组载体的菌株接种到SD-Trp,SD-trp/X-α-gal,SD-trp/X-α-gal/AbA培养基上。结果发现转化了pGBKT7空载体的菌株生长状况良好,转化了pGBKT7-NlPIGM载体的Y2H Gold菌株在SD-Trp和SD-Trp-X-α-gal的培养基中能生长,克隆颜色为白色,生长速度和克隆大小与对照组无明显区别,在SD-trp/X-α-gal/AbA培养基中不生长(图5);另外,转化菌液培养24 h后测定OD600均大于0.8,说明pGBKT7-NlPIGM诱饵重组载体对酵母菌株无毒性和自激活活性,可以用于后续的酵母双杂交实验。

2.5 酵母双杂交阳性克隆鉴定

利用mating法筛选cDNA文库,将SD-trp-Leu-His-Ade/X-α-gal/ABA平板上变蓝的阳性克隆送测序,然后与NCBI数据库进行Blastn比对,结果显示阳性克隆与数据库序列高度同源(表2)。

注:A—pGBKT7空载体转化Y2H Gold的酵母菌株,SD-Trp培养基;B—pGBKT7-NlPIGM重组载体转化Y2H Gold的酵母菌株,SD-Trp培养基;C—pGBKT7-NlPIGM重组载体转化Y2H Gold的酵母菌株,SD-Trp-X-α-gal培养基图5 重组诱饵载体自激活和毒性检测Figure 5 Self-activating activity and toxicity of recombinant bait vector identification

表2 阳性克隆测序结果比对分析

3 讨 论

高质量的cDNA文库和诱饵重组载体的构建是成功实现酵母双杂交技术的重要前提。薛进等构建了白背飞虱的酵母双杂交cDNA文库,结果显示初级文库的库容量为1.72×107CFU,滴度为1.72×106CFU/mL,Y187酵母菌株文库滴度为5.09×107CFU[13]。肖东来等人构建了灰飞虱酵母双杂交cDNA文库,检测表明初级文库的库容量为1.85×107CFU,扩增文库的总库容为1.5×109CFU,文库滴度为7.7×108CFU/mL[14]。在本研究中,我们所提取的褐飞虱RNA及纯化的mRNA质量较高,且大部分都分布在100～2 000 bp之间,达到了文库构建的要求。通过对构建的文库进行分析,结果表明构建的初始cDNA文库库容量为1.04×108CFU,高于薛进和肖东来等人构建的文库库容,远大于1×107CFU的库容量需求;次级文库库容为1.36×108CFU,次级文库滴度为3.4×107CFU/mL,虽然小于肖东来等人构建的文库滴度,但仍大于3×107CFU/mL的滴度需求。PCR结果显示文库cDNA集中在500～2 000 bp附近,从而保证了文库具有较广的覆盖度及较好的多样性和转化效果。另外,我们在双链cDNA的末端加上3个不同的接头,保证了插入的cDNA序列的方向和完整性,提高了cDNA文库的质量和筛选的完整性。

总的来说,本研究通过构建高质量的褐飞虱cDNA文库和pGBKT7-NlPIGM重组载体,筛选到了一些与PIGM具有相互作用的蛋白,为探究NlPIGM的作用机制提供了基础,但下一步还需要通过RNAi、免疫共定位、免疫共沉淀等手段来进一步确认NlPIGM与这些蛋白的相互作用。