肺癌骨转移机制的研究进展

洪方正，胡若愚，薛涛

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009; 2.东南大学附属中大医院 心胸外科， 江苏 南京 210009)

肿瘤转移是癌细胞从原发灶向远端器官扩散的过程，是造成癌症患者死亡的主要原因之一。在肺癌、乳腺癌和前列腺癌等肿瘤中，骨是第三大常见的转移灶[1]。约70%的转移性前列腺癌和乳腺癌患者伴有骨转移，约30%的转移性肺癌患者伴有骨转移[2]。就骨转移发生部位而言，大多数肿瘤主要转移到中轴骨，特别是脊柱(87%)、骨盆(63%)和肋骨(77%)[3]。 基于病变的特征性影像学表现和成骨/破骨细胞的主导地位，骨转移可分为溶骨性骨转移和成骨性骨转移。当破骨细胞介导的骨吸收占主导地位时，如肺癌或多发性骨髓瘤，骨转移的病理表现以局灶性骨破坏等溶解性病变为主。相反，在以成骨细胞活性增加为特征的骨转移中，如前列腺癌，则表现为成骨性骨转移的骨硬化病变。鉴于肺癌骨转移主要表现为溶骨性病变，本文重点放在溶骨性骨转移机制的阐述上。

1 骨转移机制

1.1 肿瘤转移的一般特性

肿瘤转移是一个多环节的复杂过程，从肿瘤最开始发生到最终形成远处转移灶的每一个步骤都有其独特的调控机制。

转移的发生是以肿瘤细胞从原发肿瘤处逃逸并进入循环而开始的。在这一环节中，肿瘤细胞的上皮-间质转化(EMT)在其中扮演重要角色。细胞的EMT是细胞失去其上皮特征并获得间质特征的过程，如细胞间黏附蛋白的丧失和上皮极性的丧失[4]；肿瘤细胞还可以通过分泌蛋白水解酶如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)溶解细胞外基质，协助肿瘤细胞逃离肿瘤基质进入循环[5]，成为循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)。

根据Paget[6]的“种子和土壤”癌症转移假说，肿瘤转移的形成不仅需要具备转移能力的肿瘤细胞“种子”，也需要适合发生转移的肿瘤细胞生长的“土壤”。肿瘤细胞若要在特定器官中定植，首先必须要营造一个适合其生存的环境。因此，转移前龛位(pre-metastatic niches，PMN)的概念应运而生。原发肿瘤分泌的细胞因子、肿瘤动员的骨髓来源细胞(bone-marrow-derived cells，BMDCs)和预转移部位基质微环境是PMN形成的三大要素[7]。肿瘤细胞在转移之前，原发肿瘤会通过选择性地释放多种细胞因子或细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)的方式主动修饰PMN，使其有利于随后转移到该龛位上的肿瘤细胞的生存和生长。而形成后的PMN也会通过诱导趋化的方式引导获得转移能力的CTCs向其趋化，并最终形成肿瘤转移灶。

一般来说，在骨转移的病变类型中分为溶骨性病变和成骨性病变。成骨性病变在肺癌中并不常见。 当肿瘤开始发生骨转移时，有转移能力的肿瘤细胞被募集到骨骼上的PMN后，刺激破骨细胞的活化，抑制骨保护素(osteoprotegerin，OPG)和成骨细胞的活性而增加骨质的吸收，造成骨溶解性的病变。骨基质溶解后释放出的生长因子又会反过来作用于肿瘤细胞促进其增殖，最终形成骨骼破坏的“恶性循环”。

1.2 肺癌骨转移

肺癌骨转移是晚期肺癌患者的常见并发症，其发生率高达30%～40%；60%的肺癌首诊时已发生骨转移[8]。近年来，虽然在肺癌骨转移的早期诊断和治疗上取得了可喜的成绩，但骨转移的预后仍然不容乐观。在丹麦的一项研究中，没有骨骼相关事件的骨转移患者的1年生存率为12.1%，而发生骨骼转移和骨骼相关事件的患者的1年生存率仅为1%[9]。所以，了解肺癌骨转移的具体机制并将其应用到临床当中去是当下的迫切需求。

1.2.1 EMT和肺癌骨转移 并非所有类型的肿瘤都易于发生骨转移，骨转移更多地发生在某些特定的肿瘤中；同时，在所有明确发生肿瘤细胞播散的病例中，似乎都会在骨髓中发现少量残留的肿瘤细胞[10]。有趣的是，在这些肿瘤中，大多数病例在其病程中并未观察到骨转移的相关病理及影像学证据。上述现象提示，原发肿瘤和肿瘤微环境可能是决定该肿瘤是否会发生骨转移的关键因素。

大量研究已经证明，EMT过程与肿瘤细胞的干性、迁移、转移及耐药等特性相关。异常的Wnt/β-catenin通路激活会诱导肿瘤EMT的发生及发展。在肺癌中，β-catenin会在缺氧环境中过表达，进而促进肿瘤细胞的迁移并诱导其形态学的改变[11]。进一步的研究[12]显示，EMT是一个持续的过程，而非两极化的状态改变，癌细胞通常处于完全上皮化和完全间质化表型之间的一种中间形态，分子表型则表现为上皮和间充质标志物的共表达，或上皮细胞标志物丧失后不出现间充质标志物的表达。目前看来，具有高度上皮-间充质可塑性的肿瘤细胞最有可能成为转移的起源细胞，因为它们能以(半)间充质状态逃离原发肿瘤，逃离后再切换回其上皮特征的表型以达到在远处转移的目的[13]。肺癌患者的血液存在处于上皮和间质状态之间的CTCs[14-16]，并且肺实体瘤中也存在处于上皮和间充质标志物共表达的细胞[17-18]。用单细胞测序技术在小鼠胚胎期的肠、肝、肺和皮肤的上皮细胞中发现了普遍的处于上皮/间质混合状态的细胞，这些细胞同时高表达上皮细胞黏附分子(epcam)、整合膜蛋白(claudins)等上皮细胞的标志物，以及波形蛋白(vimentin)富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(sparc)等间质细胞标志物[19]。值得注意的是，部分EMT细胞的经典转化因子(transition factor，TF) SNAI1/2、ZEB1/2、TWIST1/2的表达非常低，与上皮细胞基本一致。这就提示除了经典的转化因子途径外，还有其他影响EMT发生的机制存在。

1.2.2 PMN 在肺癌溶骨性骨转移中，肿瘤分泌的赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)在没有肿瘤细胞直接参与的情况下诱导了早期的溶骨性改变[20]。此外，肿瘤细胞可以通过非编码RNA调控PMN的形成并最终达到协助肿瘤转移的目的。miR-139-5p可以下调间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)中Notch-1信号传导并促进其向成骨细胞分化，该过程参与了肺癌细胞向骨骼部位转移的启动[21]。细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是近些年的研究热点，肿瘤来源的细胞外囊泡在PMN形成中担任的角色也被广泛探讨。Qi等[22]的研究表明,囊泡中的miR-660-5p可能通过靶向KLF9来调节肺癌的生存能力。Taverna等[23]发现,肺癌细胞分泌的含有表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)配体和双调蛋白(amphiregulin)的EVs可以诱导小鼠破骨细胞的分化。除了基因水平的调控外，Kim等[24]还发现，囊泡上的鞘磷脂可以促进血管的生成。携带程序性死亡受体配体(PD-L1)的EVs到达靶器官后可以抑制免疫系统，促使PMN的形成[25]。来自原发肿瘤分泌的EVs和各种因子会促进BMDCs及其他一些免疫细胞迁移至潜在的PMN处，形成免疫抑制的微环境，为肿瘤细胞的到来做好准备[26]。其中，骨髓来源的抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)被认为是PMN形成中不可或缺的一份子，其产生的血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)会上调E选择蛋白(E-selectin)以促进肿瘤细胞的黏附，致使循环中的肿瘤细胞优先归巢至该病灶并发生增殖[27]；在非小细胞肺癌的患者中，转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)刺激PMN中的MDSCs上的CD39和CD73的表达，并抑制T细胞和NK细胞的活性[28]，为肿瘤细胞的定植创造了免疫抑制的微环境。MDSCs还会分泌MMP9同时作用于VEGF的上、下游来破坏血管稳定性[29]，而血管通透性的改变和新生血管则是有利于肿瘤细胞最初定植的重要条件[30]。

目前，大量的有关PMN形成机制的研究都集中在肺内转移上，关于骨转移相关的研究很少。鉴于骨骼系统在理化、生化及解剖因素上的特殊性，有关肺转移PMN的相关机制是否同样适用于骨转移值得进一步研究。需要明确的一点是：骨骼环境特有的物理特性(刚性的基质、高钙水平、高度缺氧的环境)对于PMN形成和后续转移也有很大的影响[31]，比如在脊柱骨转移的研究中，红骨髓丰富的部位就更容易形成转移灶[32]。更有研究表明肿瘤细胞除了通过全身血液循环播散并最终导致骨转移外，椎静脉丛可能也在骨转移中起到了重要作用。椎静脉丛是从颅骨到骨盆延伸的无瓣静脉网络。在一项对290例骨转移患者的回顾性研究中，头颈部肿瘤患者的颈椎转移发生率、胸部肿瘤患者的胸骨转移的发生率、骨盆肿瘤患者的骨盆骨转移发生率均高于对照组[33]，这与肺癌、乳腺癌及前列腺癌之间骨转移的分布差异相互印证[34-35]，证明了血流动力学在骨骼转移中占据了重要地位。目前，有关肺癌骨转移仍须解决的问题包括：在软组织转移灶中观察到的机制是否适用于骨骼转移？在转移的整个过程中，PMN到底发生了怎样的动态变化？手术切除原发肿瘤后，PMN是否还会持续增加？

1.2.3 肺癌靶向骨转移 肺癌靶向骨转移的机制目前尚未得到充分的阐述。有关靶向骨转移机制的研究多集中在乳腺癌和前列腺癌上。如基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor1，SDF-1)和其受体CXCR4在乳腺癌及前列腺癌中可以将肿瘤细胞招募至骨骼上[36]；趋化因子CXCL10可以将表达其受体CXCR3的乳腺癌细胞吸引到骨骼[37]。肺癌中的CXCR4[38]和CXCL10[39]也处于高表达状态，这提示上述机制在肺癌中发挥类似促进骨转移的作用亦有可能。Valencia等[40]发现,盘状结构域受体1(discoidin domain receptor 1，DDR1)与肺癌的较低存活率有关，抑制DDR1可以使肿瘤细胞向骨骼归巢的早期肿瘤和骨的结合受损。同时，外泌体表面的整合素被认为与肿瘤特定部位转移息息相关[41-42]。但值得注意的是，外泌体整合素的研究集中在肺、脑及肝转移上；趋向骨骼的外泌体表面的整合素表达却相当有限，虽然能一定程度上诱导血管通透性改变，但完成靶向骨转移的过程显然还需要其他机制的辅助[41]。

不同于其他器官，在骨转移中血流动力学可能占据了更重要的地位。将3种肿瘤细胞系(黑色素瘤、肺癌、前列腺癌)的细胞和惰性的生物学微珠(biologically passive microbeads)分别植入小鼠脉管系统，3 h后观察到微珠和上述3种肿瘤细胞在软组织器官中的扩散存在显著差异，而在脊柱中的扩散未见明显差异，同时3种肿瘤细胞在脊柱中各部位的聚集情况也未见明显差别[43]。惰性微珠不受细胞因子等生物学因素调控，而更多反映血流动力学对移植物体内分布的影响，因此上述研究结果间接证明了，在骨转移中血流动力学的影响是胜于细胞因子等生物学因素的更重要的主导因素。这个发现也与肿瘤细胞总是更容易在靠近原发部位的椎体中定植的现象相呼应[34]。

1.2.4 肺癌骨转移的溶骨性病变 产生溶骨性转移的前提是破骨细胞的活化。肺癌细胞会分泌含有EGFR结合双调蛋白(EGFR binds amphiregulin，AREG)的外泌体诱导破骨细胞中的EGFR信号异常激活，继而上调MMP9，触发溶骨性转移[23]。来自肺腺癌的含有miR-21的外泌体也可以抑制程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)以促进破骨细胞生成。此外，癌细胞获得骨细胞的基因型和表型特性的现象称之为Osteomimicry。关于该现象的研究目前大多集中在前列腺癌和乳腺癌中[44]。Koeneman等[45]认为,肿瘤必须表达骨细胞相应的基因型或表型才能完成骨转移。利用生物信息学方法可证明高表达编码成骨细胞相关蛋白的肺癌细胞具有更差的预后和更晚的分期[46]。当然，有关其在肺癌中的具体作用还需要更多的实验去证明。肿瘤细胞会释放各种细胞因子以促进溶骨作用的发生，如甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)[47]和Notch配体Jagged1。在肺腺癌中，miR-153可以靶向Jagged1来调节癌细胞的生长和转移[48]。PTHrP作用于成骨细胞以增加NF-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)的分泌同时抑制OPG的分泌。靶向PTHrP的miRNA-33a可以减少NSCLC中的骨吸收[49]。在一项对1 149名高钙血症性肺癌患者循环中PTHrP水平的回顾性研究[50]中发现，PTHrP>150 pmol·L-1的患者中位生存期缩短(1.4个月vs.5.4个月),同时骨转移发生率升高(71.4%vs.12.5%)[50]。RANKL会与破骨细胞前体相互作用，导致其活化并最终成为成熟的破骨细胞。同时，成骨细胞还会合成OPG与RNAKL竞争性结合RANK从而抑制破骨细胞的功能[51]。因此，破骨细胞的活化及RANKL与OPG直接相关。RANKL在非小细胞肺癌细胞诱导溶骨活性的过程中是必不可少的，抑制RANKL通路不仅可以在肺癌小鼠模型中抑制肿瘤生长[52]，也减少了破骨细胞的生成并减缓转移的进程[53]。Huang等[54]发现,广泛溶骨现象的发生会释放骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)、TGF-β等进入骨基质，BMP2与成骨细胞及NSCLC细胞协同促进巨噬细胞向破骨细胞分化。TGF-β在肺癌基质中的上调会促进肿瘤的进展和侵袭[55]，同时导致溶骨因子PTHrP表达和分泌增加[56]，最终形成了骨转移中的“恶性循环”。

2 肺癌骨转移的诊断和治疗

2.1 诊断

目前由于影像学技术的进步，肺癌骨转移的检出率已大大提高。CT/MRI中骨质破坏的表现、ECT中的核素浓聚以及PET/CT中代谢值的变化都可以被视为骨骼变化的良好标志。骨代谢的生物化学标志物，如碱性磷酸酶等的变化也提示骨转移发生的可能。但确诊骨转移的发生仍然是基于病理学的最终证据。

2.2 治疗

除了传统的放化疗和手术治疗之外，针对骨转移的治疗方法还有骨改良药物、分子靶向治疗和免疫治疗等。

2.2.1 骨改良药物 如双磷酸盐可以抑制破骨细胞活性，诱导破骨细胞凋亡，减少肿瘤引起的溶骨性病变。地诺单抗能够特异性靶向RANKL，从而抑制破骨细胞活化和发展，减少骨的吸收，增加骨密度。

2.2.2 分子靶向药物 如EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)，其第一代的吉非替尼、厄洛替尼，第二代的阿法替尼以及第三代的奥西替尼，对于EGFR基因突变的非小细胞肺癌患者的治疗颇有成效[57-58]。且与单独化疗相比，以EGFR-TKI作为一线治疗的肺癌骨转移患者似乎有更好的预后[8,59]。或是以间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)融合基因为靶点的酪氨酸酶抑制剂,其第一代的克唑替尼,第二代的色瑞替尼、艾乐替尼等,对肺癌骨转移患者的预后均有正面效果[60-61]。

2.2.3 以VEGF为靶点的治疗 抗血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)的单克隆抗体贝伐珠单抗联合含铂双药化疗药物,是目前晚期非鳞非小细胞肺癌的标准一线治疗方案之一[58]。同时贝伐珠单抗与化疗联合治疗肺癌骨转移可以延长骨转移进展时间，并且降低相关不良事件的发生[62]。

2.2.4 针对免疫检查点的药物 主要有程序性死亡受体-1(programmed death1，PD-1)及其配体(PD-L1)的抑制剂。单独或与化学疗法联合使用的PD-1/PD-L1抑制剂可显著改善总生存期，而联合化疗可使无进展生存期延长[63]。

2.2.5 其他 NSCLC中的单胺氧化酶A(monoaminoxidase A，MAOA)的高表达与EMT及NSCLC临床病理特征的发展有关，MAOA抑制剂G11可通过影响VEGF、HIF1α和MMP2或MMP9来抑制耐紫杉醇的NSCLC转移及生长[64]。该发现提供了以MAOA为靶标的联合治疗药物的可行性。

血小板反应蛋白(thrombospondin-2，TSP-2)通过RANKL途径促进破骨细胞生成，并改变成骨细胞分化过程中RANKL/OPG的比例。TSP-2基因敲除可在体内抑制肺癌的溶骨转移，因此其可能成为将来治疗肺癌骨转移的靶标[65]。

3 展 望

晚期肺癌骨转移不仅影响患者的生活质量，而且增加了患者的经济负担及心理压力。目前大量关于骨转移的研究集中在乳腺癌和前列腺癌上，缺乏对调控肺癌骨转移这一过程的分子机制的报道。了解导致肺癌骨转移的机制对于探索更有效的治疗方法是非常重要的，这也体现了精准医学理念下对肺癌的精准治疗。同时大量研究聚焦于晚期患者，缺乏早期患者的相关数据，不利于转移的早发现、早治疗。因此，为更好地防止肺癌骨转移。我们认为未来的研究方向主要集中在：(1) 开发更高灵敏度和特异度的骨转移检查手段，如更精准的影像学手段或生物标志物;(2) 建立更可靠的肺癌骨转移发生的预测模型，对高风险人群进行更加严密的监控和预防，实现“早发现”“早治疗”的目的;(3) 基于肺癌骨转移的特有的机制研发新一代的药物;(4) 联合放射、核医学，设计放射性同位素粒子，进行内放射治疗。

此外，骨骼特有的特殊的理化性质及与骨髓的特殊解剖关系使肺癌骨转移机制与一般器官可能有所不同，在其他器官上观察到的有关转移的机制是否适用于骨骼转移仍有疑问。仍需更多有关肺癌骨转移的的研究来进一步阐述其相关机制，以更好地为后续治疗提供理论支撑。