2019-nCoV检测方法的研究进展

陈立娥 王延飞

滨州医学院附属医院 山东 滨州 256603

新型冠状病毒(2019-nCoV)肺炎疫情爆发以来，截至2020年6月6日，全球累计确诊病例为6 766 314例，累计死亡人数392 449人，与严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(MERS)相比，其传染性更强、传播速度更快，危害极其严重。

2019-nCoV属于冠状病毒亚科β属，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组长为29 881碱基，编码为9 860个氨基酸，具有4个结构蛋白，包含12个蛋白编码区/开放读码框，其中开放读码框lab(open reading frame lab，ORFlab)、核壳蛋白(nucleocapsid protein，N)基因和囊膜蛋白(envelope protein，E)基因区域高度保守，因此常被设计作为引物和探针的结合位点[1]。张永振课题组对其进行了病毒分离测序并公开结果后，各国对病毒的研究逐渐深入[2]。面对新冠病毒感染人数的逐渐增多，亟需更快、更准确的新冠病毒检测技术。检测技术中，病毒分离是病毒检测的金标准，但其耗时长，检测难度高，不适用临床检测工作[3]，而CT诊断不适合实验室检测。根据目前临床使用和实验证据，对新冠病毒检测的核酸检测、免疫检测、联合检测等多种临床使用和最新实验室方法进行分析总结，以期对新冠病毒的防控和人群筛查提供参考。

1 核酸检测技术

1.1 测序技术 第二代基因测序技术能够在短时间内实现高通量的未知基因组测序。2019-nCoV便是通过患者的呼吸道分泌物提取病毒RNA，构建cDNA文库进行高通量测序，随后进行基因组比对分析，从而确定为一种新型的冠状病毒。基因测序的优势是：能确定未知样本的序列，这在疫情爆发初期具有极大价值；针对临床高度疑似但逆转录聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)诊断为阴性的病例，使用测序技术可以提高准确性，并判明是否为其他致病病原体；可以检测病毒是否变异，以便改进检测手段。然而测序技术的仪器配置要求高，对检测人员的技术要求高，检测时间长，费用高，不适用于人群大规模筛查。而纳米孔靶向测序(nanopore target sequencing，NTS)技术作为一种单分子实时的测序技术，利用DNA或RNA通过生物纳米孔时产生的电流变化来进行碱基测序，且可配合小型实时测序设备，因此在即时检测(point-of-care testing，POCT)上拥有广阔的应用前景。2月29日，武汉大学团队使用NTS技术实现了10 min内高浓度呼吸道病毒样品和4 h内低浓度样本的检测，灵敏度是实时荧光定量PCR的100倍。NTS具有灵敏度高，检测范围广，成本低，反应速度快，且能进行突变监测的特点，是其他检测方法无法有效诊断时最合适的选择[4]。

1.2 PCR技术

1.2.1 RT-PCR技术 RT-PCR可以通过扩增病毒的特异性片段来定性判断是否感染病毒。其中实时荧光RT-PCR作为确诊的最常用的诊断标准之一，被选入我国《新型冠状病毒的肺炎诊疗方案(试行第七版)》。实时荧光RT-PCR的工作原理是首先将2019-nCoV逆转录为cDNA，再利用特异性引物通过变温反应扩增cDNA片段，随后用荧光信号检测每次PCR循环产物的总量。利用RT-PCR可以检测多种临床样品，例如血液、痰液、支气管肺泡灌洗液、咽鼻拭子、粪便等。RT-PCR具有灵敏、快速、特异性高、适用样品种类多、重复性好等特点，是较为理想的检测方法[5]。首个检定合格的新型冠状病毒检测产品是上海之江生物科技股份有限公司的2019-nCoV核酸检测试剂盒，该试剂盒能在2 h内完成一个样品的检测，但假阳性率较高，随后陆续有80多家生物公司开发出RT-PCR试剂盒。然而疫情紧急导致产品研发上市时间短，这些检测试剂盒的质量良莠不齐。从WHO公布的数据来看，根据2019-nCoV的基因组，已经设计出针对其上的ORFlab基因、N基因、RdRP基因、E基因，Spike蛋白，ORF1b-nsp14位点的多种扩增序列和探针。同时一步法RNA检测技术的出现，也让逆转录和扩增整合于同一个体系，减少了样品污染，缩短了检测时间，更适合大规模批量检测[6]。然而，虽然在实验室中，一步法实时荧光PCR技术检测2019-nCoV灵敏度能达到10个拷贝，但受样品采集污染，运输不规范，试剂盒质量不一等多种因素，实际临床中RT-PCR试剂盒的灵敏度在102拷贝范围。

1.2.2 数字PCR 面对RT-PCR灵敏度低的问题，蓝柯团队开发了微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)，将检测的下限值降到了RT-PCR的1/500，并且临床的总体准确率达到了94.3%，其极低的检测线适用于2019-nCoV早期诊断和临床治愈的判断[7]。数字PCR技术是一种运用泊松分布对分子直接定量的技术，其可细化为微滴式、芯片式、微流控等检测分支，但其核心原理是把体系的大量核酸制备成单分子，并在独立的反应室进行扩增检测，这使其具有高灵敏度，甚至能检测单拷贝的病毒样品。与RT-PCR相比，数字PCR的检测准确性和灵敏度更高，系统更加稳定，重复性高，可以减少样本的交叉感染。然而数字PCR技术必须配合相应的检测仪才能使用，导致其成本较高，同时由于技术新颖，暂无国家或业界标准，质控无法评价，限制了推广使用。

1.3 等温扩增技术 恒温扩增技术既具有PCR的灵敏特异性强的优点，又操作简单，设备要求低，肉眼即可确定结果，是一种适合POCT的快速核酸检测技术。目前最常用的是环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，该技术的原理是通过具有链置换活性功能的DNA聚合酶，将4对特异性引物与靶基因的6个区域退火杂交，实现等温扩增，当靶基因是RNA时，通过添加反转录酶即可实现对RNA的扩增[8]。该技术的效率较高，操作方便，但需注意操作中开盖引起的气溶胶污染，且其4对引物对靶标序列的选择性高，使其应用范围受限。

有团队报道运用逆转录LAMP设计了6个引物在65℃恒温下对2019-nCoV的ORFlab的8个不同区域进行扩增检测，灵敏度达到了97.6%[9]。中国疾病预防控制中心也利用LAMP，与公司合作开发了能在8～15min完成样品检测的试剂盒。2020年2月22日药监局批准了首个基于恒温扩增技术的2019-nCoV检测试剂盒，其能1.5 h内检测16份样品同时检测6种呼吸道病毒核酸，高效的进行人群筛查[10]。

除了LAMP，重组酶聚合扩增技术，滚环扩增技术，切割酶扩增反应，指数扩增反应等也陆续发展出高效能的试剂盒。其中，雅培公司利用等温扩增技术开发的2019-nCoV检测技术能在5～13 min得到结果，即单日能进行5万次检测，得到了美国食品药品监督管理局的应急使用授权认证。

1.4 CRISPR技术 常间回文重复序列丛集(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)系统不仅是基因编辑的利器，更是因为其具有靶向RNA的特性，能够鉴定是否存在特定序列。同时它可以与等温扩增技术相联合使用，提高检测准确度和速度。张锋团队基于此开发出SHERLOCK技术对样本处理，核酸扩增，靶核酸序列测定技术进行改造，实现了常温下无需PCR仪和离心机等设备，即可测定下限低至1拷贝的核酸检测。SHERLOCK系统采用了HUDSON核酸提取法进行核酸提取，随后利用重组聚合酶扩增的方法在两小时常温条件下快速扩增靶核酸片段，使用T7 RNA聚合酶将扩增的DNA转录为RNA后，CRISPR/Cas13系统能在crRNA的引导下，利用Cas13a在crRNA互补位置外的侧翼序列附近切割靶RNA，从而将荧光报告探针切割下来产生荧光，利用荧光信号实现核酸检测。同时靶RNA存在时，Cas13a会非特异性的切割体系中的单链RNA，因此可以高特异性的检测RNA病毒核酸[11]。

本次疫情爆发后，张峰团队在2020年2月14日成功实现基于SHERLOCK技术，针对ORFlab和S蛋白基因设计了特异性crRNA，开发出一款即时检测产品，该产品便在1 h内完成10～100拷贝/μL载量检测[12]。其比RT-PCR灵敏度和敏感性更高，检测速度更快，应用前景广阔。然而制备高质量均一化的Cas13a蛋白的难度较大，且报道中未到达SHERLOCK技术理论检测下限，需要进一步优化。

2 免疫检测技术

根据WHO的指导意见，血清检测应该作为核酸检测的补充。潜在患者的感染急性期和恢复期血清中的血清特异抗体免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)/免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)可以帮助确诊。IgM通常于患者感染2019-nCoV后3～5 d出现，浓度与时间和病毒载量相关。而18 d后IgG含量明显上升，其阳性表明进入感染中后期或既往感染。目前血清学检测试剂盒利用抗原抗体特异性结合的原理，运用了酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，化学发光法，胶体金等技术。

2.1 ELISA检测法 ELISA是一种利用抗原抗体特异性结合，在聚苯乙烯等固相载体上结合酶标的抗体或抗原，最后利用酶与底物结合的显色反应，对待测抗原或抗体进行定量的方法[13]。虽然国内有许多针对新冠病毒的ELISA试剂盒，然而不同厂家的试剂盒检测效果不一。即使ELISA能够相对定量的检测病毒核酸，但由于ELISA的操作相比化学发光法复杂，手工操作的误差较大，检测时间更长，故临床应用较少。

2.2 化学发光法 化学发光技术是利用类磁粒子包被待检靶抗原的特异性抗体，并利用吖啶酯类等化学发光标记物作为二抗，通过激发液激发后，检测发光强度，进而直接检测病毒抗原的方法[14]。特异性抗体主要针对病毒的表面蛋白或者高度保守的N、S蛋白等。

化学发光技术检测试剂盒是临床一线使用最广泛的针对IgM/IgG抗体的试剂盒。例如，重庆医科大学与博奥赛斯公司研发的试剂盒，对IgM和IgG抗体灵敏度分别为93.7%和89.6%，特异性分别为96.20%和92.41%，总计已完成13 532例检测[15]。美康公司使用硝酸纤维膜包埋抗体，并将特异性抗体标记纳米颗粒，运用纳米颗粒的显色作用，实现了对病毒蛋白进行定性检测和快速筛查。另有团队报道了使用利用合成的S蛋白肽来检测血清中IgG和IgM抗体的方法，这种合成肽的稳定性和可重复性很高，并且比直接使用病毒作为抗原更加具有特异性，临床诊断阳性率能达到81.5%[16]。

化学发光技术的免疫检测试剂盒检测快速，并且能实现高通量和低成本，适用于流行病学筛查和病程监测，然而其数据依赖高灵敏度的光电倍增管捕获光子，无法实现POCT[17]。

2.3 胶体金免疫层析技术 胶体金免疫层析技术是主流的抗体检测方法，占抗体检测市场的80%。其原理是胶体金颗粒的静电作用能结合蛋白质分子，将硝酸纤维素膜上包被病毒抗原，利用侧向免疫层析原理捕获到的胶体金标记的IgM和IgG抗体会与包被抗原形成抗原抗体复合物，由此实现信号放大，在检测线处形成红色反应线。

有团队利用这一技术开发了定点测流免疫分析技术，该技术能在15 min内同时检测临床血液样本的IgM和IgG，且监测临床阳性2019-nCoV样本准确性能达到88.66%，特异性为90.63%[18]。

然而胶体金技术的准确性和特异性会受到抗体金标记量、加样量、非特异性吸附、样品污染、患者自身抗体干扰等限制，这让胶体金技术仅能进行定性检测，且其灵敏性特异性均低于化学发光法和RT-PCR技术。但凭借其操作极其方便，结果肉眼可见，检测时间短，胶体金技术在POCT领域广受欢迎[19]。

3 实验室联合检测

在临床工作中，最常用的RT-PCR方法会带来假阳性、假阴性率高，操作繁琐的问题，而免疫检测又存在窗口期，容易受患者自身携带其他抗体的影响，因此为了提高检测的准确性，一般会选用多检测联合的方式。中国卫健委的第七版诊疗方案中明确指出应该使用“核酸+抗体”联合的检测方案来弥补单检测带来的误诊。

除了核酸-抗体联合，有证据表明2019-nCoV感染患者的血常规，生化免疫等指标均有一致的规律性变化[20]。在发病早期，患者的白细胞和淋巴细胞数量可能会减少，这提示了血常规检查的重要性。根据临床分析，淋巴细胞亚群分析可能预测疾病转归，且在重症及危重症患者中出现淋巴细胞耗竭现象为100%，对淋巴细胞亚群分析可以尽早对淋巴细胞耗竭现象进行干预[21]。

4 小结

检测技术从实验室到临床要经历四个阶段：概念认证阶段、少量样本分析阶段、大量患者参与临床试验阶段和技术商业化阶段。而疫情爆发以来，虽然各式2019-nCoV检测方法层出不穷，但大多只停留在第二步少量样本分析阶段，未能真正商业化运用。目前虽然RT-PCR的方式被质疑准确性不佳，但血清免疫学检查无法筛查低病毒载量和无症状感染者，数字PCR和SHERLOCK技术虽大大提高了灵敏度却没有行业运用标准。在RT-PCR核酸检测试剂盒能及时满足临床需要的情况下，应开始考虑如何提高2019-nCoV检测技术的灵敏度，准确性和通量，并争取能实现全自动流水线式操作或能满足POCT的要求。