元七胶囊改善小鼠失眠的机制

隋得志 李 然 李 岩 赵 岩 管 桐 高丽莎 王斌胜

1 滨州医学院中西医结合学院 山东 烟台 264003； 2 烟台市中医院 山东 烟台 264001；3 滨州医学院附属医院 山东 滨州 256603

失眠主要是指睡眠持续时间不足和(或)睡眠质量差，其特征为入睡困难和难以保持睡眠[1]。根据美国睡眠协会公布的数据显示，美国有5 000万到7 000万成年人患有睡眠障碍，每年与失眠相关造成的损失超过1 000亿美元[2]。失眠不仅发病率高，长期失眠还会导致患者对生活质量的感知差，甚至导致抑郁症、高血压、2型糖尿病等[3-6]。更有Meta分析显示，失眠与死亡增加有相关性[7]。

失眠在《内经》中称为“目不瞑”、“不得眠”、“不得卧”，与阴阳失衡、营卫失度、五脏不安等有关，治疗以半夏秫米汤、朱砂安神丸、酸枣仁汤、炙甘草汤、黄连温胆汤、安神定志丸等为主。

现代医学研究发现，失眠与γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)的代谢异常有明显的相关性[8]。GABA是中枢神经系统的主要抑制性神经递质，起着广泛的抑制调节作用，可引起深慢波睡眠量增加，巴比妥类和苯二氮卓类安眠药都是基于GABA受体介导的抑制过程发挥作用[9-10]。

元七胶囊是王斌胜教授在中医理论指导下经过多年的临床摸索研制而成，该方由三七、元胡两味药等比例组成，针对长期的、不明原因的失眠可以有效地改善失眠患者的睡眠持续时间短、入睡困难、睡眠紊乱等，临床疗效确切。但元七胶囊改善失眠的具体作用机制尚不清楚，本文拟进一步探究其作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要药品、试剂和设备 SPF级昆明小鼠150只，雄性，体质量为18～22 g，购买于济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK(鲁)20140007。所有动物实验均按照实验动物保护原则和滨州医学院医学伦理委员会的要求进行。

元胡(批号为160701，北京同仁堂)、三七(批号为20160702，北京同仁堂)，4-氯-DL-苯基丙氨酸(批号为S27337，上海源叶生物科技有限公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液(R0010，索莱宝，北京)，小鼠GABA ELISA试剂盒(ml001894，Mlbio，上海)，兔GABRA1/GABA A受体alpha 1抗体(bs-1232R，Bioss，Beijing)，beta-actin抗体(60009-1-Ig，Proteintech)，羊HRP-结合Affinipure 抗兔IgG抗体(SA00001-2，Proteintech)。

全自动酶标仪(美谷分子仪器，上海)，化学发光成像系统(Clinx，上海)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模及分组 将150只昆明小鼠随机分为5组，每组30只，分别为正常组、模型组、元七胶囊低剂量组、元七胶囊中剂量组和元七胶囊高剂量组。除正常组外，其他4组首先采用以下方法将正常昆明小鼠制备成失眠模型小鼠：将50 mg NaHCO3片剂溶于1 mL蒸馏水，配成 5% NaHCO3水溶液，与0.9%NaCl溶液混合，调整pH值至7～8，加入对氯苯丙氧酸(para-chlorophenylalanine，PCPA)并在混匀仪上充分混匀，使PCPA的浓度为30 mg/mL。每日清晨，按照PCPA 300 mg/kg的剂量腹腔注射PCPA混悬液，连续注射2 d，正常组小鼠注射同等体积的生理盐水。第一次注射PCPA混悬液36 h后，小鼠出现烦躁不安、饮水增加、进食减少、昼夜节律消失等，提示造模成功。

造模成功后，正常组、模型组给予生理盐水，元七胶囊低剂量组给予元七胶囊0.39 mg/g，元七胶囊中剂量组给予元七胶囊0.78 mg/g，元七胶囊高剂量组给予元七胶囊1.56 mg/g。每日清晨7∶00—8∶00灌胃，一天一次，连续5 d。

1.2.2 戊巴比妥钠睡眠实验 第5天灌胃结束1 h后，各组随机取6只小鼠腹腔注射戊巴比妥钠，给药剂量为0.04 mg/g，观察并记录小鼠的睡眠潜伏期和睡眠持续时间。

取材

1.2.3 小鼠血清及脑组织提取 各组小鼠摘眼球采血，将血液收集到2 mL EP管中，离心管中，室温静置30 min后，12 000 rpm×30 min离心分离血清，-80℃冻存备用；将小鼠处死后，置于冰面上取脑，同时迅速剥取小鼠脑组织，液氮快速冷冻，放入-80℃冰箱备用。

1.2.4 ELISA检测 采用双抗体夹心法检测小鼠血清中GABA的含量。按照8、4、2、1、0.5、0 μmol/ L的浓度梯度向标准样品孔加入50 μL不同浓度的标准品，取10 μL待测样品稀释5倍后加入样品孔，向每个标准品孔、样品孔中加入100 μL酶标试剂后用封板膜将96孔板封好，37℃温育60 min；用单蒸水稀释20倍配成的浓缩洗涤液洗涤后向每个孔中加入50 μL显色剂A溶液，再加入50 μL显色剂B溶液，在37℃下避光显色15 min后每孔加入50 μL终止液，反应停止。加入终止液后15 min内，空白孔调零，用酶标仪于450 nm波长处测量各孔吸光度值(OD值)。

1.2.5 Western Blot实验 称取一定量的脑组织样品加入适量裂解液，匀浆后冰上裂解30 min，4℃离心，14 000 rpm×10 min，取上清，待用。按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明进行操作，将25 mg/mL蛋白标准品用0.9%Nacl配制成0.5 mg/mL，定容至100 μL，制备标准曲线，使用酶标仪在562 nm波长处检测吸光值，根据标准曲线计算蛋白浓度。电泳在80 V 30 min和120 V 60 min的条件下进行，转膜在275 mA 90 min条件下进行。用5%脱脂奶粉室温封闭2 h。一抗(兔GABRA1/GABA A受体alpha 1抗体，1∶1000)4℃过夜孵育，TBST缓冲液洗涤3次，每次15 min，室温孵育二抗(1∶1000)2 h，TBST缓冲液洗涤3次，每次15 min，用Alpha Imager 2200仪器采集图像。

2 结果

2.1 元七胶囊对失眠小鼠的睡眠潜伏期和睡眠时间的影响 与模型组相比，元七胶囊处理各组小鼠的睡眠潜伏期均缩短，P<0.05；同时与模型组相比，元七胶囊处理各组小鼠的睡眠持续时间均延长，P<0.01(图1)。

图1 A.元七胶囊可缩短失眠小鼠的睡眠潜伏期；图1 B. 元七胶囊可延长失眠小鼠的睡眠持续时间。A. 正常组；B. 模型组；C. 低剂量组；D. 中剂量组；E. 高剂量组。与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图1 元七胶囊对失眠小鼠的睡眠潜伏期和睡眠持续时间的影响

2.2 元七胶囊对失眠小鼠血清内的GABA含量的影响 使用ELISA法检测小鼠血清中GABA含量，结果显示，模型组小鼠血清中GABA的含量低于正常组，P<0.05；低、中剂量元七胶囊治疗组小鼠血清中GABA含量较模型组均升高(低剂量组P<0.05，中剂量组P<0.01)；高剂量组小鼠血清中GABA含量也有升高，但差异无统计学意义(图2)。

A. 正常组；B. 模型组；C. 低剂量组；D. 中剂量组；E. 高剂量组。与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。图2 元七胶囊对失眠小鼠血清内的GABA含量的影响

2.3 元七胶囊对失眠小鼠的GABA蛋白表达的影响 使用Western Blot检测小鼠GABA蛋白表达。结果显示，与正常组相比，模型组小鼠GABA蛋白表达下降；与模型组相比，元七胶囊中、高剂量治疗组GABA蛋白表达明显增加，这提示元七胶囊可能通过促进GABA蛋白的表达来改善模型小鼠的失眠状况(图3)。

A. 正常组；B. 模型组；C. 低剂量组；D. 中剂量组；E. 高剂量组。图3 元七胶囊的失眠小鼠的GABA蛋白表达的影响

3 讨论

GABA为抑制性神经递质，具有镇静、抗惊厥的作用，其含量升高可使失眠患者睡眠时间延长，从而提高睡眠质量[11]。而有关GABA神经调节系统的睡眠调节机制非常复杂，GABA受体共有3个亚型，即GABAA、GABAB、GABAC受体，三种受体在受到刺激时具有相似的催眠作用[12]。GABAA受体是一个Cl-孔，具有巴比妥类药物、苯二氮卓类药物和神经类固醇的结合位点。而GABAC受体也由包含一个Cl-孔的三部分组成，对GABA的敏感性较GABAA受体和GABAB受体更高，且脱敏过程要慢得多。当受到抑制性神经递质GABA刺激后，Cl-通道开放频率增加，导致大量的Cl-内流，引起突触后膜超极化后抑制神经元放电，减少单胺类神经递质去甲肾上腺素(NE)的释放而导致睡眠。

改善失眠药物的评价通常以戊巴比妥钠睡眠实验为主要方法[13]。本研究发现，元七胶囊可以缩短失眠小鼠的睡眠潜伏期并能延长失眠小鼠的睡眠时间，证实了元七胶囊的疗效。为进一步探究其作用机制，本研究检测小鼠血清中GABA的含量发现，低、中剂量组小鼠血清中GABA含量较模型组均升高，高剂量组小鼠血清中GABA含量也有升高，而Western Blot实验也证实了元七胶囊治疗后小鼠脑组织中GABA含量的升高。故本研究认为，元七胶囊改善失眠的机制与调节GABA表达有关。

元七胶囊临床疗效确切，动物实验也显示出其良好的效果，但是对其作用机制的研究尚不够深入，后期将运用蛋白质组学技术探究正常小鼠、失眠小鼠以及元七胶囊治疗后小鼠蛋白表达的差异，并对差异蛋白进行深入分析，以探究元七胶囊的作用途径。