泸香型白酒窖泥微生物生态功能研究进展

张宿义，刘 淼，沈才洪，林 锋，罗惠波，侯长军，熊燕飞，杨 艳，李德林

（1.泸州老窖股份有限公司，四川泸州 646000；2.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州 646000）

白酒是世界六大蒸馏名酒之一，由于白酒的酿造工艺不同和地理环境的差异，形成了多种香型的白酒，泸香型白酒(又被称作浓香型白酒)产量及市场份额占据整个白酒行业的70%左右[1]，浓香型白酒以粮谷为主要原料，利用中高温大曲为糖化发酵剂，采用泥窖固态法发酵，经蒸馏、陈酿、勾兑而成，具有绵柔甘洌、芳香浓郁、香味协调等特点。白酒酿造过程中，酒醅在环境微生物、大曲微生物、窖池微生物的相互作用下，以窖池为载体，经过复杂的物质能量代谢过程进行发酵[2]，浓香型大曲白酒生产的一个重要特征就是泥窖固态发酵，这就使得浓香型白酒对窖池依赖程度较大，然而窖池的功能载体是窖泥，由此说明，窖泥在白酒酿造的过程中发挥了重要作用，窖泥中相关功能微生物对白酒的口感与品质产生了较大的影响。因此，对窖泥中微生物的研究具有十分积极的意义。本文将对白酒窖泥微生物多样性、主要功能微生物对白酒风味的贡献以及新老窖泥的评价标准进行综合介绍，并综述浓香型窖泥微生物研究进展，以期为白酒生产提供理论指导。

1 窖泥在白酒中的作用

窖泥作为我国白酒酿造过程中特有的环境样品，是一种高含水量、高腐殖质与低含氧量的特殊性土壤[3]。窖泥是浓香型白酒酿造过程中重要的微生物来源，部分微生物在发酵过程中进入白酒糟醅中繁殖和代谢，产生复杂多样的代谢产物，形成种类丰富的风味物质，影响白酒风格和品质。白酒质量的优劣与窖泥微生物菌群多样性息息相关[4]，正所谓“千年老窖，万年糟”和“酒好全凭窖池老”[5]。优质窖泥中约富集了200 多种厌氧微生物，这些微生物经过长时间驯化与选择，它们相互共生、同时相互竞争，通过复杂的相互作用，形成了稳定的生态系统[6]，同时，长期的白酒生产使窖泥微生物的种类逐渐稳定，同时产香味物质的功能微生物数量也呈上升趋势。目前研究发现，新窖泥中以乳杆菌为主，而老窖泥中以梭菌纲、拟杆菌纲和产甲烷菌纲为主[7]。

窖泥是酒体生香功能微生物的繁殖载体，功能微生物协同发酵为酒体香味物质的形成提供反应底物，为浓香型白酒风味特征的形成奠定了基础，窖泥可以产生大量的己酸菌，并通过己酸菌产生大量的己酸，进而与乙醇反应生成浓香型大曲酒的主体香—己酸乙酯[8]。在发酵过程中，窖泥通过发酵过程中产生的黄水的介导，与酒醅之间不断进行微生物和物质能量的交换，为酒醅发酵提供丰富微生物种群的同时，又实现了窖泥自身的新陈代谢[9]。综上所述，窖泥的主要作用为：(1)作为微生物的繁殖载体，向入窖酒糟中提供发酵产香微生物，发酵生成浓香型白酒中的香味物质；(2)发挥“以窖养糟”的作用，向酒糟中渗透其经过长期发酵吸附的挥发性微量香味成分，使酒味更加丰满和谐。

2 白酒窖泥中功能微生物的多样性

窖池的池壁泥和池底泥所处的理化环境差异很大，池底泥常年处于发酵过程所形成的黄水的浸泡中，更偏向为厌氧环境，而池壁泥中氧气的含量更多，其所处的环境直到发酵后期才有可能成为厌氧状态。因此，窖泥中的微生物多为严格厌氧和兼性厌氧的细菌和严格厌氧的古菌组成，窖泥中兼性及专性厌氧微生物主要包括乳酸菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）、产己酸菌属（Caproiciproducens）、梭菌属（Clsotridium）、Petrimonas、嗜蛋白菌属（Proteiniphilum）、甲烷囊菌属（Methanoculleus）和甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）等原核微生物及酵母（Saccharomyces和Pichia）和霉菌（Rhizopus和Aspergillus等）等真核微生物[10-11]。值得一提的是，窖泥中细菌数量远多于真菌，且窖泥中原核微生物群落α-多样性及β-多样性与窖泥窖龄及质量均有明显的关联性，如新窖和退化窖泥中厚壁菌门数量明显多于老窖泥和优质窖泥，拟杆菌门和广古菌门则相反[12]。

2.1 细菌群落多样性

由于理化环境的差异，导致窖泥中细菌群落多样性与真菌群落多样性存在显著差异，Zheng 等[13]、Ding 等[14]和汤斌等[15]对不同的地区窖泥研究发现，泸州老窖窖泥细菌分类为梭菌科(Clostridiaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、互养菌科(Synergistaceae)、鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、Clostridiales Incertae Sedis XI、Lanchnospiraceae 和Plannococcaceae 共计8 个科；叙府酒业窖泥细菌归属于5 个科，包括乳杆菌科、梭菌科、互养菌科、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)和醋杆菌科(Acetobacteraceae)；而古井贡酒窖泥细菌仅被精确分类于真杆菌(Eubacterium)、梭菌、乳杆菌和互营单胞菌4 个属。赵东等利用高通量测序技术解析五粮液窖泥原核微生物的群落结构，研究结果表明，五粮液窖泥与其他区域的浓香型窖泥微生物群落结构存在显著差异。以上研究结果中乳杆菌科、梭菌科与互养菌科在不同地区窖泥中均被检测到，说明不同地区的窖泥细菌群落结构存在显著差异的同时，也存在一定的相关性。叶光斌等[16]利用克隆文库分析窖泥细菌微生物群落，进一步证实芽孢杆菌纲、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Synergistetes(互养菌门)等为窖泥优势微生物群落。同一地区，不同空间位置的窖泥微生物也存在差异性，胡晓龙等人采用高通量测序技术对老窖池(35 年)中4 个不同位置(窖壁上、中、下层和窖底)的窖泥原核微生物群落多样性进行了解析，结果表明，厚壁菌门(71.1%)和拟杆菌门(16.3%)为供试窖泥的主要优势菌门，群落α-多样性(Chao1 和Shannon)分析表明不同位置窖泥之间存在差异但并不显著(P＞0.05)。

李永博等[17]基于PLFA 组成的主成分分析对100 年窖龄窖泥与30 年窖龄窖泥进行微生物多样性分析，结果表明，100年窖龄窖泥的微生物含量均高于30 年窖龄窖泥，且细菌的数量与丰度均高于其他类型微生物，对两种不同窖龄窖泥磷脂脂肪酸含量进行主成分分析发现，其中30 年窖龄窖池中细菌为主要变异菌群，100 年窖龄窖池主要变异菌群为细菌与真菌。随着窖龄增加，革兰氏阳性菌与真菌对群落结构的影响减少，革兰氏阴性菌与放线菌对群落结构的影响在增加。任聪等[18]通过对新、老窖泥的微生物菌群结构和进化关系，进一步发现窖泥中主体己酸菌为梭菌纲瘤胃菌科的己酸菌属(Caproiciproducens)微生物，且以乳酸和葡萄糖利用型己酸菌为主。

2.2 真菌群落多样性

真菌是窖泥微生物的重要组成部分，具有较高生物量[19]。但相关研究表明，窖泥真菌种类较少，仅分类为威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、曲霉属(Aspergillus)、白地霉属(Galactomyces)和地霉属(Geotrichum)[14]。真菌多为好氧微生物，窖池厌氧环境不利于其生长，导致窖泥中真菌微生物多样性较低。

2.3 窖泥微生物群落的演替

窖泥微生物演替是指随窖龄的推移，窖泥微生物群落和生态环境定向有序的发展过程，演替的主要标志是群落在物种组成上发生了改变。

王明跃等[20]以克隆文库技术对不同窖龄窖泥古菌进行研究，结果表明，通过16SrDNA 克隆文库技术能够系统地认识不同窖龄窖泥细菌群落的基本构成及演替规律。窖泥微生物在50 年前后变化明显，50 年之前窖泥中古菌种群结构变化较大；50年之后，古菌群落结构趋于稳定。这与黄治国等[21]的研究结果相一致，结果发现窖龄越长，细菌群落结构越稳定。

2014 年，Tao 等[22]利用454 测序技术首次系统研究了窖泥细菌在1—50 年间的演替。该研究将演替分为起始驯化期(1年)、演替期(1—25年)、成熟期(25 年后)等3 个阶段，其中窖泥pH 值、NH4+和乳酸的含量是影响细菌演替的主要因素，起始驯化期，窖泥富含乳杆菌属，由于乳酸的积累使窖泥呈现高酸度环境。演替期，窖泥pH 值随乳杆菌的衰亡和NH4+含量的增加而上升，拟杆菌门和螺旋体门(Spirochaetes)大量繁殖，细菌多样性增加；有机酸、H2和CO2的含量不断增加，促进了能促己酸生成的产甲烷菌(Methanogens)的生长。成熟期，细菌群落呈现稳定状态，梭菌属IV 簇、梭菌科和Anaerobrancaceae的丰度提高并与窖泥己酸含量呈显著正相关(P＜0.01)，说明它们对己酸乙酯的生成具有积极作用。

3 窖泥中主要功能微生物对白酒风味的贡献

3.1 产酸微生物对白酒风味的贡献

酸类物质是浓香型白酒中的重要成分，是形成酯类物质和芳香化合物的重要前体[23]，浓香型白酒中主要酸类物质乙酸、乳酸、丁酸和己酸[24]对白酒风味有重要影响。勾文君等对不同窖龄浓香型白酒窖泥中产丁酸和己酸细菌进行研究，发现窖泥中梭菌纲(Clostridia)微生物所产生的丁酸及己酸、拟杆菌纲(Bacteroidia)和互营养菌纲(Synergistia)微生物产生的乙酸、丙酸等物质对酒体风味的形成发挥了重要作用。除此之外己酸菌(Caproiciproducens)与梭菌(Clostridiaceae_1)对维持窖泥中微生物群落结构稳定也有一定作用。董琪等[25]利用溴甲酚紫指示剂试管培养基和pH 计对窖泥中微生物进行筛选，经气相色谱法测量后发现其中2 株菌可产生9种酸。由于窖泥中产酸微生物种类较多，且有机酸对白酒质量影响较大，因此对浓香型白酒窖泥中微生物与有机酸合成关系需进行更深入的研究。

3.2 产醇微生物对白酒风味的贡献

白酒在发酵过程中除了产生大量乙醇外，在微生物的作用下通过酒精发酵途径或相应氨基酸降解途径还可生成高级醇[26]，此外部分酸类物质在一定条件下也会还原生成醇。高级醇是白酒中醇甜和助香的重要成分[27]，能与酸形成酯类物质使酒体丰满。适量的高级醇可赋予酒体特殊的香味，使酯香更浓，但过量的高级醇使酒质变差，使人“上头”，加重醉酒程度[28]。甄攀[29]对泸州老窖不同窖龄的窖泥中高级醇进行研究，发现异戊醇和丙醇在所有窖泥样品中均有检出，其中异戊醇在样品中分布均匀，丙醇在样品中含量差异较大，但无明显变化规律，正丁醇只在200 年以上窖龄中检出。随着窖龄增加，醇类物质总含量呈现下降趋势[29]。何培新等[30]对某酒企窖泥进行分离纯化，对其中8 个代表性梭菌菌株的挥发性代谢物进行检测，得到23 种醇类物质，包括对浓香型白酒香气贡献度较大的3-甲基丁醇、2-乙基己醇及正戊醇等[31]，不同菌株合成醇类能力差异较大，3-苯丙醇、正辛醇、苯乙醇和正丁醇能被5 种及以上梭菌代表性菌株合成，而部分醇类仅能被一种菌株合成，因此可通过强化窖泥中特定微生物数量来增强白酒中特殊醇类香味。

3.3 产酯微生物对白酒风味的贡献

酯类物质是白酒中芳香的主体，其中乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯被誉为浓香型白酒中“四大酯”[32]，酯类化合物大都具有较强的挥发性，具有果实气味或独特芳香气味，因此表现出的气味特征较强。乙酯类物质主要由有机酸和乙醇在一定条件下生成，此外部分梭菌属微生物也可以合成酯类物质。何培新等发现克氏梭菌(C.kluyveri)等主要产生己酸、己酸乙酯，而C.cadaveris的含量与短链脂肪酸乙酯，即乙酸乙酯、丁酸乙酯的合成呈正相关。郑佳等[33]对宜宾五粮液15 年窖池中不同空间位置窖泥进行顶空固相微萃取(HSSPME)并结合气质联用(GC/MS)进行分析，发现窖泥中总酯类物质随着窖池深度的增高不断增加，可能由于窖池中的物质交换主要通过“黄水”进行[34]，“黄水”在重力作用下下渗，造成底部窖泥酯类含量逐渐增加。鲁少文等[35]研究发现，人工窖泥中加入新型瘤胃梭菌CPC-11可以显著提高窖泥中己酸乙酯的含量，有助于窖泥中形成良好微生物群落，促进酯类物质积累，加快窖泥成熟。

3.4 产醛酮类微生物对白酒风味的贡献

醛酮类物质也是泸型酒中重要的风味组分，其中3-甲基丁醛和2-辛酮具有较高的香气强度，糠醛呈现杏仁味、烤味，醛酮类化合物的存在极大的丰富了泸型酒的香气层次[36]；芳蒲秀鑫利用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用仪对两种不同窖泥中挥发性物质进行检测，共检测到9 种醛酮类物质。施珂等[36]发现泸香型白酒中喃醛酮类化合物含量较少，可能由于该物质性质活泼，在萃取过程中可能转化为其他物质。赵东在五粮浓香型糟醅及窖泥中发现3 种醛酮，分别是丙酮、2-戊酮、3-甲基丁醛。吴文睿等[37]对古井贡酒中芽孢杆菌进行研究，发现其中6株菌能大量产生3-羟基-2-丁酮，该物质具有奶油香味，可赋予酒体特殊的芳香气味。

4 窖泥质量评价

窖泥作为白酒生产的重要部分，其质量好坏直接决定白酒的品质，目前对窖泥的评价主要分为以下几个方面。

4.1 含水量

成熟窖泥中水分含量为30 %～50 %，水是微生物细胞的重要组成成分，在微生物体内起着运输、溶剂、参与化学反应、构成生物体等作用，因此窖泥水分含量对窖泥品质有直接影响。研究发现，随着窖龄增加，窖泥中水分含量呈上升趋势。孟雅静等[38]也发现老窖池池底窖泥中水分含量高于新窖池，而池壁窖泥水分含量则不存在显著差异。胡晓龙等[39]研究发现退化窖池中窖泥呈现低含水量的特性。虽然不同地区品种的窖泥含水量之间存在较大差异，水分含量不能完全反映窖泥质量，但在人工老窖泥制作、窖泥日常养护、窖泥退化治理和窖池管理等方面水分含量具有重要作用[40]。

4.2 矿物元素

研究表明，新窖泥在成熟过程中可能会析出白色颗粒，产生窖泥“退化现象”，甚至板结[12]。刘大江等研究发现，窖泥中白色颗粒的主要物质为乳酸钙。随着新窖逐渐成熟变为老窖，窖泥中微生物种类和数量逐渐增加，乳酸钙的含量会逐渐减少。张会敏等[3]通过研究浓香型白酒新老窖池中窖泥钙含量、pH值、乳酸之间关系发现，在0～3 cm的厚度范围内老窖泥中钙含量、pH 值、乳酸相关性较强，而新窖泥三者相关性较弱，因此可通过检测窖泥中钙离子含量探究窖池的“退化”与“钙化”。对老窖泥中Ca、K、Zn 进行检测后发现其含量均高于新窖泥，Fe、Mg 含量基本保持不变，老窖泥中Mn 元素含量低于新窖泥[41-42]。王艳丽等[43]研究发现，不同品质的窖泥中铁元素含量呈现差异，退化窖泥＞新窖泥＞优质窖泥，在退化窖泥中，由于受氧化还原电位的影响，铁元素主要以Fe2+存在，和乳酸结合形成乳酸亚铁，对窖泥中微生物造成毒害作用，从而使窖泥品质下降。微生物在生长过程中与某些无机盐和微量元素息息相关，因此通过对窖泥中矿物元素的检测可以了解微生物的生长情况。

4.3 有效磷

窖泥中的有效磷是指能被微生物所利用的酸溶性磷和吸附态磷[44]，其中ATP和ADP可为生物体提供能量，磷元素也是构成生物膜、核酸等的主要成分，有效磷的含量在一定程度上可反映窖泥中微生物的整体活性。王艳丽等[43]研究发现优质窖泥、新窖泥与退化窖泥相比，优质窖泥中有效磷含量高于新窖泥和退化窖泥，而且有效磷含量与窖泥中微生物数量呈现正相关。任道群等[45]对不同窖龄窖泥中有效磷进行研究也发现，随着窖龄增加（窖泥质量上升），窖泥中有效磷含量呈现增加趋势。

4.4 其他成分

窖泥中的铵态氮主要通过曲药和窖泥中的微生物分解有机质而形成，李学思等发现窖泥中铵态氮随着窖龄增加而增加，且窖底铵态氮含量高于窖壁，同时窖泥中速效钾含量也呈现上述变化趋势。王艳丽等[43]发现优质老窖泥中铵态氮＞新窖泥＞退化窖泥。

上述研究表明，不同时间、空间窖泥理化成分存在差异，但通过对同一产地或厂家窖泥进行监测，可以利用所测得的数据分析窖泥质量变化，相比于监测微生物种类与数量更为方便。

5 展望

浓香型白酒固态发酵过程中通过微生物菌群相互作用和独特的生产工艺形成了浓香型大曲白酒窖香浓郁、绵甜爽洌的风格特征。窖泥中微生物群落结构的多样性及复杂性，使得对窖泥微生物的研究进展缓慢。虽然现代分子生物技术已大量应用于窖泥微生物的研究，但是传统微生物学技术对窖泥微生物的研究仍占有重要的地位。窖泥在白酒的生产中发挥了举足轻重的作用，然而目前对窖泥的评价，依然没有统一标准。在目前的生产中还是经常以窖龄长短、感官、产酒等指标来判断窖泥的好坏。但是这些判定都存在一定局限性，无法数据化，只能依靠经验。因此，为进一步掌握白酒窖泥微生物多样性与窖泥质量以及在代谢上的关系，宏基因组学、微生物代谢组学等现代分子生物技术将有助于加深对窖泥微生物代谢活动的认识和了解窖泥微生物群落代谢机制，同时，如果明确了微生物在窖泥中的分布和功能，可以把微生物作为评价窖泥状态的关键指标之一，更有利于对窖泥的评价。