固态发酵酱香型白酒过程中霉菌的研究进展

（茅台学院，贵州仁怀 564500）

中国白酒是世界著名蒸馏酒之一，其分为浓香、清香、酱香、米香四大基础香型。其中，酱香型白酒采用独特的酿造工艺，如高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温馏酒、生产周期长、大量用曲、多轮次发酵和酒体长期贮存等工艺特征[1-2]，这样的工艺造就了酱香型白酒的独特风味：酒体酱香突出、香味幽雅细腻、酒体醇厚、回味悠长、空杯留香[3-5]。

酱香型白酒采用传统的开放式酿造工艺，通过制曲、堆积、发酵过程网罗大量环境中的微生物，整个过程中细菌、酵母菌和霉菌是其酿造过程中三大功能微生物体系[6]，其中，细菌是白酒酿造过程中产酱香风味物质的重要动力来源，酵母菌是发酵产酒精和产高级酯类的动力来源，而霉菌是发酵前期淀粉等大分子物质糖化的主要动力来源[7-8]。

霉菌在酱香型白酒的主要功能是产生多种活性酶，能够分泌糖化酶、液化酶、纤维素酶、蛋白酶、酯化酶、脂肪酶、果胶酶、漆酶等，对原料中淀粉、蛋白质等的降解具有重要作用，使得原料经过一段时间的反应后糖类及氨基酸含量升高，在为其他微生物的生长代谢提供基础物质的同时，也为酱香酒酒体风味物质的形成奠定了基础[9-10]。

随着微生物技术的发展，白酒霉菌的研究也越来越深入，对各种霉菌在白酒中的作用也得到了进一步的研究，本文综述了酱香型白酒从制曲、堆积到窖内发酵过程中霉菌的研究情况，旨在为酱香型白酒功能性霉菌的研究提供参考。

1 酱香型高温大曲中霉菌研究概况

大曲是直接影响白酒产量和质量的关键因素，主要分为高温大曲、中高温大曲、中温大曲，不同类型大曲所含有的微生物和酶类的组成与其制作工艺和制作环境息息相关。酱香型白酒大曲属于高温大曲，采用传统的制作工艺，曲料被制成规整的曲块，经过40 d 的发酵，大曲品温逐渐升高到60 ℃，之后再经过6 个月以上储存成熟期，大曲才能使用。

1.1 酱香型高温大曲中霉菌多样性分析

酱香大曲的成曲过程是对环境微生物的网罗和筛选，经过多年的研究分析得知，酱香型大曲中微生物是以细菌、酵母菌和霉菌三大菌群为主，在不同的制曲环境和曲块放置位置，微生物呈现出不同的生长规律，但总体规律为细菌种类数量最为丰富，霉菌次之，酵母菌数量较少。

目前，通过研究发现，酱香大曲中的霉菌主要分为7 个属：曲霉属、毛霉属、根霉属、犁头霉属、红曲霉属、青霉属、拟青霉属[11-12]。其中，曲霉属具有良好的耐热、耐酸热特性，为酱香大曲中种类最丰富的霉菌，也是酿酒环境中的主要产酶菌，能够促进大曲中淀粉等原料的降解。酱香大曲中检测出的曲霉主要包括黑曲霉、米曲霉、黄曲霉等。毛霉属也是大曲中重要的霉菌，大量富集于大曲的低温培菌期，能够分泌蛋白酶促进大曲的分解。根霉属一般与毛霉属共存，由于其菌丝可以深入到大曲基质中形成网状菌丝体，因此，对大曲成型有重要贡献。酱香大曲中的根霉属则主要为米根霉，其能够分泌大量糖化型淀粉酶。青霉属能够分泌聚糖酶系，对木质纤维具有良好的降解能力[13]。

由于人工设定的培养条件远远不及自然环境复杂，因此纯培养技术只能对环境中微生物总量的1%进行培养，极大地限制了人们对微生物完整群落结构的认识。近年，通过传统培养方法与现代技术的联合使用，从酱香大曲中检测出了传统研究方法所不能检出的霉菌，也使我们对酱香白酒霉菌的多样性有了更加深刻的认识。

2006 年，范光先等[14]采用传统可培养分离技术，对茅台酒制曲发酵过程微生物的消长情况进行了系统研究，共分离得到霉菌35 种，主要包括拟内孢霉、白地霉、青霉、拟青霉、伞枝梨头霉、微小毛霉、总状毛霉、球形毛霉、米根霉、聚多曲霉、黑曲霉、黄曲霉、绿垂曲霉、日本曲霉、温特曲霉、构巢曲霉、紫红曲霉、红色红曲霉、烟色红曲霉等菌种。

2012 年，Liu 等[15]通过PCR-DEEG 法对茅台大曲微生物进行分析，发现真菌分布于散囊菌目、毛霉菌目和酵母目内4 个不同属级分类的4 个不同种属，即曲霉属（Aspergillus）、嗜热真菌属（Thermomyces）、Thermomucor属及Trichomonascus属，同时检出M.racemosus、T.crustaceus等不易培养菌。

2014 年，班世栋等[16]采用传统可培养技术，从酱香型白酒大曲中分离得到Aspergillus、红曲霉属（Monascus）、毛霉属（Mucor）、青霉属（Penicillium）、Rhizomucor等19 株霉菌。同年，王彩虹[17]使用基因文库法，对郎酒大曲霉菌进行鉴定，发现曲霉属、嗜热真菌属、Thermomucor属为主要优势菌株，并检出扫帚状曲霉、Thermomucor indicaeseudaticae等不易培养菌。陈笔[18]采用PCR-DGGE 法在酱香型白酒大曲中分别检测到7 中霉菌，其中，A.oryzae和P.variotii是优势菌株，相对丰度分别达到38.2%和27.1%。其他霉菌如M.ruber、A.terreus、P.decumbens和G.argillacea等也能被检测到，但是他们的丰度都小于2.9%。

2016 年，王晓丹等[19]从遵义地区6 种酱香大曲中分离筛选得到的1 株散囊菌，经形态学及分子生物学鉴定确定该菌株为阿姆斯特丹散囊菌。

2018 年，夏玙等[20]高通量测序分析大曲中真菌群落结构，发现嗜热子囊菌属（Thermoascus）、根毛霉属（Rhizomucor）、曲霉菌属（Aspergillus）等霉菌是大曲中的优势真菌类群。同年，李静心等[21]通过高通量测序技术对白酒高温大曲进行分析，表明霉菌是构成高温大曲的主要真菌，其中Thermomyces lanuginosus和Wallemiasp.为高温大曲所特有，优势菌株Thermomyces lanuginosus、Aspergillus intermedius、Wallemiasp.等分别占总水平的80.49 %、10.95%和4.25%。

2020 年，朱治宇等[22]采用高通量测序技术，对茅台镇酱香白酒7 个主酿区酿造大曲和环境样品霉菌进行解析，明确了Aspergillus、Byssochlamys、Monascus、Thermoascus、Thermomyces、Rhizomucor等霉菌属是酱香白酒酿造大曲中的优势霉菌；Alternaria、Aspergillus、Byssochlamys、Cladosporium、Fusicolla、Lecythophora、Monascus、Penicillium、Phoma、Pyrenochaeta、Thermoascus、Thermomyces、Toxicocladosporium等霉菌属是酱香白酒酿造环境中的优势霉菌。

1.2 酱香型高温大曲中霉菌消长规律

高温制曲工艺是酱香型白酒生产的一大特色，由多种菌种参与混合发酵而成，曲块发酵时间长，发酵中后期品温高。由于霉菌特殊的细胞结构及生长特性，如耐热孢子、营养体适合在潮湿、多氧环境下生长繁殖，极高的制曲温度为许多耐高温霉菌的生长繁殖代谢创造了条件，因而在整个制曲过程中，霉菌的种类和数量在发酵中前期达到高峰[23]。

杨代永[24]通过对茅台高温大曲制作过程进行跟踪发现，酱香高温大曲发酵过程中微生物总数以细菌为主，高达2.118×107cfu/g·曲，霉菌次之，为6.446×106cfu/g·曲；酵母最少，仅有6.6×104cfu/g·曲。种类却以霉菌为最多，高达51 种；细菌次之，为41种；酵母最少，仅发现6种。前中期（20 d）霉菌的数量几乎无变化，维持在入房时霉菌数量，达顶温后才开始大幅度增长，后期随着水分含量的下降，数量也随着有小幅度的下降。

同样，印璇等[25]在对北大仓酒厂高温大曲培曲过程中微生物变化的分析中，发现霉菌在制曲前中期数量不高，曲坯从入房到第一次翻曲阶段霉菌数量一直保持在3.0×103cfu/g 左右，无明显变化。在第二次翻曲时数量有所增加，为8.1×103cfu/g。从第二次翻曲到出房，霉菌大量生长繁殖，数量在出房时达到高峰，为4.5×105cfu/g。

综上所述，大曲制作过程中霉菌生长情况及变化规律大致相似，在高温大曲的培曲中前期，随着高温大曲品温的升高，霉菌大量富集，之后随着大曲发酵的进行，由于水分的下降等霉菌数量有所下降。但是，研究也发现，在整个大曲制作过程中，北方高温大曲中霉菌的数量始终不及南方（低100 倍左右），可能是北方霉菌区系不及南方，同时，也有可能是南北气候、温差、地貌等环境因素的不同所引起的，说明大曲制作过程中微生物的变化受环境影响极大。

2 糟醅堆积过程中霉菌研究概况

堆积是酱香型白酒独有的工艺之一，是富集有益微生物、酶类的重要工序，也是在多种酶类作用下生成酒体香味物质和其前体物质的重要过程。高温堆积首先将原料或酒醅在加入大曲拌匀后，收拢成堆，温度约30 ℃，堆积4～5 d。当堆顶温度达到45～50 ℃，堆积的酒醅散发香甜味和酒香味时，即可入窖发酵。

从长期实践及试验结果来看，高温堆积有三大作用：（1）网罗、富集环境中微生物，以利于窖内酒精发酵；（2）糖化发酵：将淀粉等酶解为可发酵糖，同时也将蛋白质水解为氨基酸；（3）生香作用：生产酱香物质或酱香前体物质，因此堆积发酵的好坏会直接关系到最终白酒的质量和产量。

2.1 糟醅堆积过程中霉菌多样性分析

近年来，关于白酒堆积过程中微生物的演变规律研究有很多，报道发现，堆积过程中优势菌株主要为细菌和酵母菌，数量占微生物总数的99 %。同时，虽然不同酒厂的发酵工艺相似，但不同的大曲、不同的酒厂发酵车间环境微生物多样性的差异化也影响着堆积酒醅的微生物多样性。

2007 年，唐玉明[26]采用微生物分离培养法研究四川古蔺郎酒酒糟堆积过程微生物变化时发现，堆积过程霉菌类型以黄曲霉类和根霉类为主。

2012 年，陈笔[18]采用PCR-DGGE 法，对贵州某白酒厂第三轮堆积样品进行跟踪研究，发现在堆积发酵期间只检出P.variotii、A.oryzae、A.terreus和R.microsporus，其中P.variotii是优势霉菌，比例超过霉菌总数的90%。

2017 年，尚柯[27]采用高通量测序技术，对山东某白酒厂酱香型白酒酿造生产周期8 个轮次酒醅进行分析，发现堆积过程中原核类微生物种类占总检出微生物总体的88 %，数量占总检出微生物的91%。其中，各轮次堆积酒醅中检出的霉菌有红曲霉属、曲霉属、帚枝霉属、被孢霉属等，堆积前期各轮次堆积酒醅中优势霉菌有红曲霉属、被孢霉属，堆积后优势霉菌为曲霉属、帚枝霉属。

2017 年，黄蕴利等[28]对XJ 酱香型白酒二轮次堆积、窖池发酵酒醅样品进行分析，发现二轮次堆积过程中绝对优势细菌属有Bacillus、Enterococcus、Lactococcus、Lactobacillus；绝对优势真菌属有Thermoascus、Thermomyces、Candida、Aspergillus。

2019 年，吕锡斌[29]分析贵州茅台酒股份有限公司制酒车间，下沙、造沙轮次微生物，发现下沙轮次经高温堆积发酵至发酵结束，优势菌主要为Weissella paramesenteroides、Pediococcus acidilactici、Lacto-bacillus plantarum等乳酸菌，且相对丰度为80 %以上。造沙堆积经高温堆积至发酵结束，优势菌主要为Lactobacillus panis、Pediococcus acidilactici、Acetobacter ghanensis，均为产酸微生物，且相对丰度为90%以上。

2.2 糟醅堆积过程中霉菌消长规律

关于堆积过程中霉菌消长规律的研究较少，唐玉明采用微生物分离培养法研究四川古蔺郎酒酒糟堆积过程微生物变化时发现，霉菌类数量在堆积初期比酵母菌类高1～2 个数量级，但随着堆积时间延长，除堆下可能因温度较低氧含量相对较高而使霉菌略有增长外，其余各堆点都呈现下降趋势，尤其是堆心，中后期几乎检测不到霉菌类。同时，作者也对各轮次堆积的微生物进行跟踪分析，发现酵母菌数量和细菌中非芽孢细菌数量有较大幅度增长，霉菌数量略有降低[26]。

同样的，袁再顺[30]采用分析生物学高通量测序技术研究贵州某酱香型白酒高温堆积过程时发现同样现象，其报道堆积过程中优势霉菌有曲霉、丝衣霉、红曲霉等，随着堆积发酵的进行，数量均呈现下降趋势。

3 酒醅窖内高温发酵过程中霉菌研究概况

窖内高温发酵是指在无氧环境下，微生物分解葡萄糖等有机物，产生酒精、二氧化碳等不彻底氧化产业，同时释放少量能量的过程。有研究表明，在酱香型白酒窖内发酵过程中，窖池中部的温度最高可达37 ℃，平均温度为30 ℃。

窖内发酵是堆积发酵的延续，但由于窖池发酵属于无氧发酵，且入窖后氧气含量呈现至上到下的梯度减少，而霉菌又属于好氧微生物，因此，入窖后霉菌数量也呈现梯度分步：上层＞中层＞下层[8]。同时，窖内发酵后蒸馏出的上、中、下层原酒的风格也不相同，上层原酒酱香味突出，中层原酒醇厚香甜，下层原酒则窖香突出。可见，窖内发酵对酱香型白酒风味物质的形成起到重要作用。

3.1 酒醅窖内高温发酵过程中霉菌多样性分析

窖内高温发酵是各类微生物协同的作用，影响白酒的风格和质量，因此关于窖内卫生的研究也一直备受关注。发酵酒醅中常见的霉菌包括曲霉、根霉、红曲霉，这些霉菌产生的糖化酶、蛋白酶、液化酶、纤维素酶、酯化酶、果胶酶等直接关系到淀粉等原料的利用及酱香物质的形成，在酒醅发酵中具有重要的作用和功能。

2012 年刘雯雯[32]以黑龙江省齐齐哈尔市北大仓集团有限公司酿酒车间的酱香酒窖池为分析对象，对酒醅内霉菌的群落组成进行研究，发现Alternaria、Aspergillus、Cladosprium、Eurotium、Geotrichum、Monascus、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Stachybotrys、Mucor等类群的霉菌，在酒醅发酵某个阶段的相对频率可以达到10 %以上，而Geniculosporium和Scopulariopsis两个类群属于出现频率较低的稀有种类。

2013 年，孙剑秋等[31]从北大仓酒醅内分离到的霉菌被鉴定为13属23种，其中链格孢、曲霉、枝孢、散囊菌、地霉、红曲、脉孢菌、拟青霉、青霉、葡萄穗霉和毛霉等在酒醅发酵某个阶段的相对频率在10%以上，而曲梗霉和帚霉两个类群在酒醅中属于出现频率较低的稀有种类。

2017 年黄蕴利等[28]对XJ 酱香型白酒二轮次堆积、窖池发酵酒醅样品进行分析，发现窖池发酵上层酒醅中存在的主要细菌属类有Lactobacillus、Acetobacter、Bacillus，窖池发酵中层酒醅中的主要细菌属类有Lactobacillus、Bacillus，窖池发酵下层酒醅中的主要细菌属类有Lactobacillus。

同年，李欣等[33]研究福建建瓯黄华山酿酒有限公司发酵酒醅微生物多样性，发现窖内发酵酒醅的优势微生物为乳杆菌属、醋酸杆菌属、青霉菌属、毕赤酵母属、曲霉属、嗜热子囊菌属、假丝酵母属。

2019 年，袁再顺[30]采用分析生物学高通量测序技术研究贵州某酱香型白酒发酵过程时发现，窖内发酵酒醅中共检测到相对丰度高于0.01 %真菌属17 个，主要包括假丝酵母属（Candida）、未分类的散囊菌目(unclassified_o_Eurotiales)、嗜热真菌属（Thermomyces）、热子囊菌属（Thermoascus）、青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）、丝衣霉属（Byssochlamys）、拉桑索尼亚真菌属（Rasamsonia）、未分类的小囊菌科（unclassified_f_Microascaceae）、红曲霉属（Monascus）、毕赤酵母属（Pichia）、毛孢子虫属（Trichosporon）、威克汉姆酵母（Wickerhamomyces）、unclassified_o_Olpidiales、未分类的真菌科（unclassified_k_Fungi）、unclassified_o_Sordariales 和木拉克酵母属（Cystofilobasidium）。

3.2 酒醅窖内高温发酵过程中霉菌消长规律

由于窖内发酵属于无氧发酵过程，且随着发酵的进行有机酸和乙醇大量增加，因此霉菌在窖池发酵过程中不断失去生物活性或死亡。

唐明玉[34]在郎酒生产窖池中，霉菌发酵前期含量呈下降趋势,数量维持在102～103cfu/g 糟,到发酵中后期又出现回升,并逐渐趋于稳定,数量稳定在102cfu/g糟数量级。

以上结论与陈笔的结论一致，其在对贵州某白酒厂第三轮窖内酒醅进行跟踪研究时，发现在进入窖池发酵后，霉菌种类以及每种的相对含量持续减少至发酵结束[18]。

孙剑秋[31]在研究北大仓酱香型白酒酿造过程中霉菌消长规律也得到同样的结论：窖池上中下层酒醅霉菌数量变化规律基本一致，发酵开始后霉菌数量急剧下降，发酵至第7 天霉菌数量短暂回升，发酵后期菌体数量再次呈现出减少态势，直至发酵结束。可见，在郎酒、贵州某白酒、北大仓白酒等酱香型白酒生产过程中，窖内酒醅中霉菌的消长规律遵循类似规律。

同时，孙剑秋[31]也发现：由于各种霉菌的生长代谢特性不同，它们在酒醅中消长规律也不尽相同。其中，曲霉与青霉两类霉菌的数量最多，在酒醅发酵过程中可分离到。曲霉类霉菌始终是优势菌株，特别是发酵后期占分离菌株的50 %。青霉类霉菌在封窖初期霉菌中占有优势，但随后逐渐减少，发酵中后期又有所回升，直至发酵结束所占比例再下降。红曲霉则随着发酵进行数量逐渐增加。枝孢属霉菌则是发酵前期的优势菌株，但逐渐减少，中后期未能检出。由此可见，随着发酵的进行，各类霉菌的数量和种类会不断变化，酒醅内霉菌种群、数量、生态分布的不同，对不同层次酒醅酒体的差异会产生一定影响。

4 展望

酱香型白酒中各香味物质含量通常为十万分之一到百万分之一，甚至是千万分之几[35]，从大曲的制备到酒醅发酵的过程中，酿酒微生物发生着复杂的协同作用，生成了多种特殊香味物质。因此，对白酒的研究要从香味物质开始，而香味物质的研究则要从酱香白酒酿造过程中微生物入手，重点了解各微生物的发酵机理及相互之间的作用，之后再采用基因工程手段融合或选育优良性状菌株，将其运用到工业生产中。

目前，酿酒微生物的研究主要是针对某一菌株，且很多菌株的发酵机理也不清楚，也存在着很多很难培养或不可培养微生物，再加上白酒的酒体风味、质量与酿造环境、微生物有着相互作用，给酿酒微生物的研究带来了很大的困难。同时，白酒酿造是各微生物之间相互作用的结果，因此，要阐明霉菌在白酒酿造过程中的作用与机理就需要着眼于微生物的群体效应，可以从微生物多样性、分子生物学、蛋白质组学、生物信息学、代谢组学等方面展开研究，以探索各微生物构成的复杂、精细、微妙的白酒酿造微生物代谢网络。