GMP检查中发现微生物检查方面的常见不足

杨雁莉

（云南省食品药品监督检验研究院 云南 昆明 650000）

GMP即药品生产质量管理规范，GMP要求药品生产企业具备良好的生产设备，合理的生产过程，完善的质量管理和严格的检测系统，确保最终产品质量符合法规要求。

微生物检查作为药品安全性的重要指标，涉及检验项目较多，既包括无菌药品成品、部分原、辅料的无菌检查、非无菌药品的成品、中间品、辅料的微生物限度检查，直接接触药品的包装材料的微生物限度检查，制药用水的微生物检查，也包括洁净区环境和操作人员的洁净度检查，药品中可能的微生物污染来自水系统、原料、设备、人员和环境等，微生物检查不但能评价药品本身的卫生质量，也能客观的反映生产的过程控制和加工工艺，故而规范的进行微生物检查有助于生产合格、有效药品[1-2]。

自《中国药典》1995年版正式收载微生物限度检查法以来，经过20多年的努力，检验方法日趋完善，并逐渐与国际标准接轨，在2020年版《中国药典》中又增加了1108中药饮片微生物限度检查法，使检验方法更加标准、规范。但有部分检验人员没有接受过微生物专业技能培训，缺乏无菌操作意识，在实际操作中不能严格按照标准操作规程执行，导致检验的结果受许多复杂因素的影响而易造成误差。

在近几年的检查过程中，主要发现存在以下问题：

1.对进行无菌检查、微生物限度检查所需对照菌株，《中国药典》有严格的规定，对菌株进行保藏和传代是药品微生物检查质量控制的重要一环。在某些企业QC实验室标准储备菌株和工作菌株未严格区分，标准储备菌株只可每月或每周1次用于制备转种的工作菌株，工作菌株不能替代标准菌株，从菌种传代记录中和菌种管的编码上就没有对两者进行区分，同一支菌株既用于检验又用于转种，导致菌株反复开启，易造成转种的新代菌株出现老化、退化、变异、污染等情况[3]。

2.在转种和保藏过程中，还要观察菌落形态，注意其生物学特征典型稳定，并做纯度、生物特性检查，如染色镜检、生化鉴别等实验室所需关键指标的确认，转种的菌种出现形态变异、菌落变异等老化、退化、变异、污染情况，应即时灭菌销毁。但部分药品生产企业检验人员缺乏相关经验，只知道传代次数超过五代的菌种后才销毁，不注意确保菌种的活性和纯度，检查时应现场查看保藏菌种的情况，同时查看是否有保藏菌种的相关观察情况和对关键指标进行确认的记录。

3.铜绿假单胞菌接种到胰酪大豆胨琼脂培养基斜面上传代培养后，如在冰箱中保存，易发生菌体自溶而死亡，应在室温保存。但仍有某些微生物检验人员不了解该特性，把所用菌种都置于冰箱保存。

4.为了应对检查，只要有相应的验证方案及报告，不管验证结果的正确与否。微生物限度检查做计数方法适用性试验时，如发现供试品有抑菌活性，需要通过增加稀释液或培养基的体积、加入适宜的中和剂或灭活剂、采用薄膜过滤法等方法单用或联合使用来消除供试品的抑菌活性，验证过程较为复杂，需操作人员有较强的微生物检查专业知识。但某些清热解毒的中成药处方含有抗菌作用中药材，在药品说明书或药品宣传手册中也提及经药理研究XX药品具有杀灭常见的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等功效，但部分企业QC检验人员做的该药品的计数方法适用性试验报告中，又显示该药品金黄色葡萄球菌等试验组菌落减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值在0.5～2范围，没有抑菌活性，可以采用常规的平皿法进行微生物限度检查，自相矛盾。

5.微生物限度检查供试品的制备，不考虑供试品的理化特性和生物学特性，供试品一律采用《中国药典》1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法中水溶性供试品制备方法来稀释供试品进行试验，而供试品中污染的微生物分布具有随机性、不均匀性的特点，故而要求供试品不一定要完全溶解于稀释液中，但要均匀分散，形成均一、稳定的供试液分散体系，否则会给实验结果引入较大误差。在做方法适用性试验前应根据供试品特性（如aw值、pH值、产品的成分和抑菌性），综合考虑后采取适宜的方法制备供试液，经验证后纳入方法适用性报告。

6.2015年版《中国药典》非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法中，计数方法适用性试验要求“试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每1 mL供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于100 cfu”。“所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%”。即从供试液制备就需加入测试用菌株（特殊情况除外），不同于以前测试用平皿中直接加入菌株，这样使测试用菌株与供试品作用充分，能较好的模拟供试品污染情况，减少系统误差，但操作步骤也较之前《中国药典》规定复杂，部分药品生产企业的计数方法适用性报告中未体现该步骤的操作过程（如具体描述了多少毫升的供试液加入多少毫升的试验菌液，每1 mL试验菌液含菌量大概是多少cfu），只笼统的照抄上述标准，没有反映真实的试验过程。

7.某些QC人员未严格按照《中国药典》中微生物检查方法的要求进行操作，如在检查现场查看洁净区的使用记录，近期进行了XX批号XX药品的微生物限度检查，按时间计算，应处于平板培养阶段，但在培养箱中只查见胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板；或按检验原始记录显示供试液制备了两个稀释级，每个稀释级每种培养基制备了各2个平板，但现场培养箱查见的平板，要么少一个稀释级的平板，要么每个稀释级只做一个平板；或无菌检查中培养容器分别按各培养基规定的温度培养不少于14 d，部分QC实验人员认为7 d不长菌后面也不会长，不到14 d即取出处理。

8.微生物检验原始记录中，照抄《中国药典》的文字叙述，没有反映真实的检验过程，如先叙述“胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30～35℃培养3～5 d，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20～25℃培养5～7 d，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。”再有一张表格填写了每种培养基每个稀释级的菌落数的点计情况，从其原始检验记录中不能反映在具体在何种温度条件下进行培养，也没有反映培养的具体天数。

9.部分企业QC实验室灭菌后培养基的储存条件和储存时间未进行验证。琼脂平板最好现配现用，如置冰箱保存，一般不超过一周，且需密闭包装，曾经在药品生产企业见到环境监测用的平板，保存期限订为一月，室温保存未密封，平板表面已经脱水开裂仍准备使用。

10.GB/T 16294-2010《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》中对培养基的要求为“大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或沙氏培养基（SDA）或用户认可并经验证了的培养基”，需氧菌计数采用大豆酪蛋白琼脂培养基，霉菌和酵母菌计数采用沙氏培养基，该国家标准要求采用两种培养基或经验证了的培养基，从而能更全面的反映洁净区的污染情况。药品生产企业应该根据实际情况（如地域、季节，某一阶段的污染情况等）进行综合考察，对在环境监测过程中检测到的菌落进行鉴定，以确认企业在环境监测时需采用的培养基类别。某些药品生产企业的洁净区沉降菌监测操作规程上直接规定，只采用大豆酪蛋白琼脂培养基监测沉降菌，没有进行考察，无相关数据支持[4]。

11.在进行非无菌药品微生物限度检查中控制菌检查时，不注意选择正确的限度标准。《中国药典》2015年版四部通则1107非无菌药品微生物限度标准，规定有兼用途径的制剂，“应符合各给药途径的标准”，某些企业会只按常用的给药途径进行检查。另外“含脏器提取物的化学药品、生物制品、不含药材原粉的中药制剂”、“含动植物源成分或矿物的化学药品或生特制品”不得检出沙门氏菌，这就需要企业对产品的工艺、原辅料的来源（是否有动物来源，植物、矿物质来源的是否经过提取）来综合判断是否应该做沙门菌检查。

12.GB/T 16294-2010《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》中，5.3.2项规定“在动态测试时，则须记录生产开始的时间及测试时间”，5.5项规定“若为动态测试，则还应记录现场操作人员数量，现场设备运转数量及位置等”，在某些企业沉降菌动态监测与静态监测原始记录共用一个模板，只有简单的培养皿菌落计数，记录无法反映监测时的真实情况，如在某个采样点，从开始生产到结果用了几个培养皿，各皿的菌落计数等[5]。

规范地进行微生物检查，“人”是最关键的因素，大部分的缺陷都可归结到人员培训不到位上，故而从事药品微生物检查工作的人员应具备微生物学或相近的专业知识背景，并应加强对微生物专业知识和操作技能的培训，如微生物专业知识，无菌操作，培养基制备、消毒灭菌、贮藏，菌种鉴定、传代、保藏，无菌检查方法、微生物检查方法、洁净区域的微生物监测，经考核后合格方能上岗。