体外扩增的Vγ9Vδ2 T细胞对肺癌细胞的杀伤作用

蒲 波，余才锋，孙 锎

（重庆三峡中心医院呼吸与危重症医学科，重庆 404000）

肺癌是全球癌症死亡的主要原因，死亡人数占全球癌症死亡患者的18.4%，位居癌症死亡人数的第一位[1]。近60%的肺癌在初诊时即为转移性[2]。肺癌患者5年存活率仍低于5%[2]，因此寻找肺癌的有效治疗手段仍是近些年研究的热点。

γδT细胞代表T细胞的一个特殊亚群，其细胞识别相关抗原不具有主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）限制性，被认为是连接先天和适应性免疫反应的桥梁[3-4]。γδT细胞根据表面分子表达可分为Vγ9Vδ1 T细胞（主要分布于上皮相关的淋巴组织）和Vγ9Vδ2 T细胞（主要分布于外周血）亚群[5-6]。其中Vγ9Vδ2 T细胞以杀伤功能为主，在抗肿瘤免疫和防止病原体入侵方面有重要的作用，在肿瘤免疫治疗中展现出良好的潜力[7-10]。程序化死亡分子（programmed death-1，PD-1）是一种免疫负调节分子，与其配体PD-L1相互作用，对机体的免疫功能发挥抑制作用。多项研究[11-13]已证实，PD-1分子在肺癌的发生和发展中有重要的作用，多种针对PD-1的单克隆抗体已被用于治疗肺癌[14-15]。关于Vγ9Vδ2 T细胞对肺癌细胞的杀伤情况及PD-1对Vγ9Vδ2 T细胞的调节机制鲜有报道。本文分离肺癌患者外周血Vγ9Vδ2 T细胞并体外扩增，观察对肺癌细胞的杀伤情况，探讨PD-1对Vγ9Vδ2 T细胞杀伤功能的影响及相关机制，以期为肺癌患者Vγ9Vδ2 T细胞免疫疗法的应用提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集重庆三峡中心医院2019年1月至12月经病理诊断为肺癌的患者共20例，其中男性15例，女性5例。所有患者术前均未接受化疗和放疗。患者年龄46~80岁，平均（60.15±10.42）岁。所有患者均知情同意，本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）分离

无菌抽取肺癌患者外周静脉血5 mL，在无菌环境中转入15 mL无菌离心管中，加入5 mL RPMI-1640培养基（Gibco公司）稀释后混匀。于50 mL离心管中加入5 mL的淋巴细胞分离液（Biolegend公司），然后将稀释的血液缓慢沿离心管壁加到淋巴细胞分离液的上层，800×g离心20 min后，吸取上层血清和下层淋巴细胞分离液中间的白膜层，加入装有10 mL无血清RPMI-1640培养基的50 mL离心管中，混匀后400×g离心10 min；弃上清，再加入培养液重复上述操作；最后用1 mL含10%胎牛血清（Gibco公司）的RPMI-1640完全培养基将细胞沉淀重悬，台盼蓝染色计数后制备成浓度为2×106个/mL的细胞悬液。

1.3 γδT细胞扩增方法

anti-pan-TCRγδmAb抗体（Beckman公司）包被。取干净无菌的24孔板一个，于24孔板的2个孔中每孔加入10μL anti-pan-TCRγδmAb（0.05 mg·mL-1）及500μL RPMI-1640培养基；将24孔板置于37°C孵箱孵育2 h；取出24孔板，弃去孔中液体，于孔中加入制备好的上述PBMC悬液2 mL，37°C、5%CO2培养箱中培养。在培养的第5天，弃去旧培养基，采用PBS缓冲液洗涤2遍，加入新鲜培养基继续培养；待培养至第14天时收集扩增的γδT细胞，采用流式细胞仪分析纯度及细胞亚型。

1.4 流式细胞术

固相化抗体扩增后的细胞以含1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA；Sigma公司）的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS；Hyclone公司）；洗涤2次后，加入相应荧光抗体（PE-anti-CD3抗体和FITC-anti-TCRγδ抗体/PE-anti-CD3抗体和FITC-anti-Vδ1抗体/PEanti-CD3抗体和FITC-anti-Vδ2抗体/PE-anti-CD3抗体和FITC-anti-Vδ2抗体以及APC-anti-PD-1）（Biolegend公司），4℃避光孵育30 min；以含1%BSA的PBS洗涤2次后，细胞重悬于0.1 mL 1%多聚甲醛固定液中待流式细胞仪检测。

1.5 Vγ9Vδ2 T细胞杀伤功能检测

采用CytoTox 96R非放射性细胞杀伤检测试剂盒（Promega公司）定量测量乳酸脱氢酶（LDH）。具体方法[16]：Vγ9Vδ2 T细胞和肺癌细胞系分别按10∶1、20∶1和40∶1的比例进行共培养。37°C、5%CO2培养箱中孵育6 h后，吸取50μL培养上清转移到酶分析板中，向酶分析板中加入检测缓冲液（50μL/孔），盖好平板，室温避光孵育30 min，向每孔中加入50μL终止液，在590 nm记录吸光值，根据吸光值作标准曲线评估细胞杀伤能力。

1.6 Vγ9Vδ2 T细胞杀伤封闭实验

采用CytoTox 96R非放射性细胞杀伤检测试剂盒，分析阻断Fas/FasL途径和PD-1/PD-L1途径对细胞杀伤的封闭作用。穿孔素-颗粒酶途径封闭实验中，在37°C条件下，采用100 nmol·L-1穿孔素/颗粒酶途径的阻断剂（CMA）（Sigma公司）预处理Vγ9Vδ2 T细胞1 h；在37°C条件下，分别采用FasL（Biolegend公司）中和抗体和PDL1（Santa Cruz公司）中和抗体封闭Vγ9Vδ2 T细胞中FasL和PD-L1 1 h。之后按照1.5实验步骤进行操作。

1.7 细胞脱颗粒情况检测

Vγ9Vδ2 T细胞和肺癌细胞系NCI-H446细胞按照效靶比40∶1的比例混合置于24孔板中，24孔板离心使细胞沉淀于底部充分接触，37°C、5%CO2培养箱孵育6 h。随后收取细胞置于15 mL离心管中离心，加入1 mL含1%BSA的PBS洗涤液重悬于eppendorf管中，充分混匀后250×g离心8 min，弃上清。细胞沉淀以0.1 mL含1%BSA的PBS重悬，于液体中加入FITC-anti-TCRVδ2抗体（Biolegend公司）和PE-anti-CD107a抗体（Biolegend公司）进行孵育，流式细胞仪进行检测，分析CD107a阳性的细胞占总杀伤细胞的比例，评价其脱颗粒能力。其中，TCRVδ2为Vγ9Vδ2 T细胞表面标记，而CD107a为脱颗粒细胞的标记物。

1.8 Vγ9Vδ2 T细胞裂解性颗粒极化情况检测

分别将Vγ9Vδ2 T细胞和肺癌细胞NCI-H446悬液稀释至1×107个/mL。取Vγ9Vδ2 T细胞和肺癌细胞NCI-H446悬液各100μL混匀，20×g离心3 min；37°C、5%CO2培养箱孵育20 min；混合细胞转入poly-D-lysine包被的2孔细胞培养板（购自BD Biosciences公司）中，室温孵育1 h；弃去培养基，1 mL PBS洗2次；4%多聚甲醛1 mL室温固定20 min；1 mL PBS洗2次；0.5 mL透化缓冲液室温处理细胞30 min；加入含3μg·mL-1穿孔素抗体的染色Buffer室温染色1 h；1 mL PBS洗3次，每次5 min；将片子于空气中吹干；采用Pro－Long Gold Antifade Reagent封片，在激光共聚焦下随机分析100个细胞，根据Vγ9Vδ2 T与肺癌细胞形成的突触数量，判断细胞极化情况。

1.9 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析。数据均采用均数±标准差（±s）表示，两组间数据比较采用t检验，三组间比较使用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外扩增肺癌患者外周血γδT细胞比例及亚型分析

流式细胞术检测肺癌患者外周血初始分离情况下γδT细胞比例为（3.53±2.21）%；采用anti-pan-TCRγδmAb固相化扩增14 d后，γδT细胞比例可增加至（82.5±13.4）%（P＜0.01）。扩增的γδT细胞中Vγ9Vδ1 T细胞比例为（42.4±7.92）%，Vγ9Vδ2 T细胞比例为（40.1±8.51）%。见图1。

图1 流式细胞术检测肺癌患者外周血γδT细胞比例及亚型

2.2 Vγ9Vδ2 T细胞对肺癌细胞系的细胞毒作用

对3例肺癌患者外周血扩增的γδT细胞进行流式分选，以获取纯度＞90%的Vγ9Vδ2 T细胞用于杀伤实验。与对照组相比（单纯肺癌细胞），体外扩增的肺癌患者外周血Vγ9Vδ2 T细胞对NCI-H446细胞和A549细胞均具有杀伤效果（P均＜0.05）。见表1。

表1 Vγ9Vδ2 T细胞对肺癌细胞系的细胞毒作用（%）

2.3 体外扩增Vγ9Vδ2 T细胞表面PD-1表达分析及其对Vγ9Vδ2 T细胞杀伤功能的影响

体外扩增肺癌患者外周血Vγ9Vδ2 T细胞表面均存在不同程度的PD-1表达。采用PD-L1封闭抗体封闭NIC-H446细胞和A549细胞表面PD-L1作用后，Vγ9Vδ2 T对肺癌细胞的杀伤能力增强［NCI-H446细胞：（35.24±4.12）%vs.（20.04±2.85）%；A549细胞：（20.14±1.95）%vs.（13.21±1.74）%］（P均＜0.01）。见图2。

图2 Vγ9Vδ2 T细胞表面PD-1表达分析及其对Vγ9Vδ2 T细胞杀伤功能的影响

2.4 Vγ9Vδ2 T细胞对肺癌细胞的杀伤作用主要依赖于穿孔素-颗粒酶途径

采用穿孔素-颗粒酶途径抑制剂CMA处理Vγ9Vδ2 T细胞后，Vγ9Vδ2 T细胞对NCI-H446细胞和A549细胞的杀伤作用均降低（P均＜0.01）；而采用FasL中和抗体封闭Fas-FasL途径后，Vγ9Vδ2 T细胞对NCI-H446细胞和A549细胞的杀伤作用无变化（P均＞0.05）。见图3。

图3 穿孔素-颗粒酶途径在Vγ9Vδ2 T细胞杀伤功能中具有重要作用

2.5 阻断PD-1可增加Vγ9Vδ2 T细胞裂解性颗粒极化

流式细胞染色结果显示，阻断PD-1作用后，Vγ9Vδ2 T细胞脱颗粒方面能力无变化（P＞0.05）。激光共聚焦实验结果显示，阻断PD-1作用后，Vγ9Vδ2 T细胞与肺癌细胞间的突出增多（P＜0.01）。见图4。

图4 Vγ9Vδ2 T细胞脱颗粒及裂解性颗粒极化情况检测

3 讨论

本研究结果显示，采用anti-pan-TCRγδmAb固相化扩增肺癌患者PMBC 14 d后，γδT细胞纯度可达80%以上，其中Vγ9Vδ2 T细胞比例和Vγ9Vδ1 T细胞比例相似，各占一半。前期已有研究证实[16]，健康人PMBC经14 d扩增后，γδT细胞纯度也可达80%以上，但其中主要为Vγ9Vδ2 T细胞，可占80%左右，仅有一小部分为Vγ9Vδ1 T细胞（比例＜10%）。健康人和肺癌患者外周血扩增γδT细胞亚型的不同，推测可能与肺癌患者Vγ9Vδ1 T细胞的免疫抑制功能有关，从而抑制了Vγ9Vδ2 T细胞的增殖。已有研究[17-19]证实，Vγ9Vδ1 T细胞与多种肿瘤的免疫逃逸有关，且Peng等[20]研究结果显示，在乳腺癌患者外周血扩增的γδT细胞中Vγ9Vδ1 T细胞比例也增加。

流式细胞术结果显示，体外扩增肺癌患者外周血Vγ9Vδ2 T细胞表面均存在不同程度的PD-1表达，在阻断PD-1作用后Vγ9Vδ2 T细胞对肺癌细胞的杀伤能力增强。已有大量研究[11-13]发现PD-1的表达与杀伤性T细胞的杀伤功能抑制有关，且已证实PD-1分子在肺癌的发生和发展中具有重要的作用。PD-1抑制剂的出现改善了晚期肺癌患者的前景[14-15]。2015年以来，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准多种PD-1抑制剂用于肺癌的一线和二线治疗。

PD-1抑制剂可联合化疗、放疗或小分子抑制剂等联合疗法治疗肺癌[21-24]。目前临床还未见PD-1抑制剂联合过继免疫治疗的研究进展。本研究从基础研究角度阐释PD-1抑制Vγ9Vδ2 T细胞杀伤功能的机制，证明Vγ9Vδ2 T细胞杀伤肺癌细胞的主要途径是穿孔素-颗粒酶。Vγ9Vδ2 T细胞通过穿孔素-颗粒酶途径杀伤靶细胞需要脱颗粒和裂解性颗粒极化两个步骤[25]。颗粒酶和穿孔素存在于细胞的胞浆颗粒中，活化的Vγ9Vδ2 T细胞将颗粒酶和穿孔素释放进入细胞间隙。穿孔素可以在细胞膜上形成孔道，增加细胞膜通透性，引发靶细胞裂解。另外，穿孔素还引起裂解性颗粒极化，在细胞质、胞浆和细胞核重新分布，使颗粒酶聚集在裂解部分，促进靶细胞裂解[26]。流式细胞术结果显示阻断PD-1作用后，Vγ9Vδ2 T细胞脱颗粒方面能力并未增加，而裂解性颗粒极化水平增加。说明PD-1主要是通过抑制Vγ9Vδ2 T细胞裂解性颗粒极化从而抑制Vγ9Vδ2 T细胞对肺癌细胞的杀伤能力。然而，本研究仍存在一定的不足，如未对PD-1抑制Vγ9Vδ2 T细胞的裂解性颗粒极化的信号机制开展进一步的研究。因此，进一步的信号机制研究也是未来关注的重点。

综上所述，肺癌患者外周血扩增Vγ9Vδ2 T细胞在体外对肺癌细胞具有杀伤作用，且主要依赖于裂解性颗粒的极化；而PD-1抑制肺癌患者外周血扩增Vγ9Vδ2 T细胞的杀伤作用主要通过抑制裂解性颗粒极化而实现，为阐明肺癌患者外周血扩增Vγ9Vδ2 T细胞杀伤肺癌细胞的作用机制提供了一定的证据支持。