UPLC-MS/MS法同时测定狗皮膏中2种大黄蒽醌类成分含量的研究

刘紫衡，吕邵娃，景梦晓，付婷婷，王艳宏,李永吉

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

狗皮膏始载于明代陈文治所著《疡科选粹》，自1963年起，收载于历版《中国药典》。狗皮膏由生川乌、生草乌、青风藤、大黄、乳香、没药、冰片等29味药物组成[1]，具有祛风散寒，活血止痛，用于风寒湿邪、气血瘀滞所致的痹病，或跌打损伤、闪腰岔气、局部肿痛；或寒湿瘀滞所致的脘腹冷痛、行经腹痛、寒湿带下、积聚痞块。在国家药品监督管理局官方网站搜索“狗皮膏”得到40条记录，涉及杭州朱养心、贵阳济仁堂等30个生产厂家。目前，《中国药典》狗皮膏的质量标准中尚未建立含量测定方法。

在狗皮膏制作过程中，药材饮片需经高温油炸，所含化学成分的结构易发生改变，前期课题组发现，大黄素、芦荟大黄素等两种蒽醌类成分结构相对稳定，可作为含量测定的对象。狗皮膏组方药味较多，成分复杂，2020年版《中国药典》一部收录狗皮膏的处方、制法、功能主治等内容，检查项下仅要求符合外观性状、软化点、重量差异等通则各项规定，并未收录详细质量标准等，且目前为止对其研究报道较少[2]，为完善相关内容，课题组前期研究已鉴定出大黄素、麻黄碱等27个有明确来源的中药成分。通过参考相关文献[3-5]，本实验首次采用UPLC-MS/MS同时测定狗皮膏中两种大黄蒽醌类含量测定的方法，为进一步完善狗皮膏的质量标准提供实验依据，对于狗皮膏的全面质量控制有一定的应用和参考价值。

1 材料与仪器

1.1 材料

色谱甲醇、乙腈(Merck KGaA公司)；质谱乙酸(Merck KGaA公司)；蒸馏水(屈臣氏公司)；大黄素对照品(批号：MUST-18110810，纯度≥98.7%)、芦荟大黄素对照品(批号：MUST-18091910，纯度≥98.3%)均购于成都曼斯特生物科技有限公司，狗皮膏由实验室自制。

1.2 仪器

Xevo-TQD三重四极杆质谱仪带有Waters Masslynx V4.1数据工作站、ACQUITYBEH C18色谱柱(上海沃特世科技有限公司)；New Classic电子天平(New Classic)；电子天平N-1300旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司)；移液枪(Thermo Fisher Scientific)；SB-5200D型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

ACQUITY BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters)色谱柱；以乙腈为流动相A，0.1%乙酸为流动相B；大黄素、芦荟大黄素梯度洗脱条件为：0～3 min，30%～60%A，3～10 min，60%～60%A；流速为0.3 mL·min-1；温度30 ℃；进样量为0.4 μL。

2.2 质谱条件

Waters UPLC-TQD三重四级杆液质联用仪，电喷雾(ESI)离子源，扫描方法为MRM，具体条件见表1。

表1 目标成分的MS参数

2.3 对照品溶液的制备

分别精密称取大黄素、芦荟大黄素对照品，置于10.00 mL量瓶中，加入色谱级甲醇配制成0.39 μg/mL、0.36 μg/mL，为对照品溶液，备用。

2.4 供试品溶液的制备

分别取不同市售厂家的狗皮膏，去除膏药背衬，精密称取药膏10.00 g，置于洁净烧杯中，加入甲醇30.00 mL，将狗皮膏均匀铺于烧杯中，使之与溶剂充分接触，超声处理4 h，静置，放入冰箱冷藏72 h，趁冷过滤，重复过滤3次至溶液无油状，将滤液减压回收，色谱级甲醇溶解，转移至10.00 mL量瓶中，定容，0.45 μm微孔滤膜滤过，作为狗皮膏供试品溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性考察

分别取大黄素、芦荟大黄素对照品溶液和供试品溶液，按“2.3”项下进行制备，对色谱图进行对比分析可知，在大黄素、芦荟大黄素出峰位置无其他杂质峰出现，峰形较好，见图1～4。证明该方法的专属性较好。

图1 大黄素对照品溶液MRM图

图2 供试品溶液中大黄素溶液MRM图

图3 芦荟大黄素对照品溶液MRM图

图4 供试品溶液中芦荟大黄素溶液MRM图

2.5.2 线性关系、检出限与定量限考察

分别精密量取适当对照品于10.00 mL量瓶中，用甲醇稀释，其中大黄素的浓度为0.11 mg/mL，芦荟大黄素浓度为0.10 mg/mL，使用适当比例甲醇进行连续稀释溶液制备出系列的标准溶液。其中大黄素的浓度为0.11、0.22、0.55、0.77、1.10 μg/mL，芦荟大黄素的浓度为0.10、0.20、0.50、0.70、1.00、1.50、2.00 μg/mL，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜。取上述不同浓度样品进样测定。绘制大黄素、芦荟大黄素、大黄酚的标准曲线。结果显示，大黄素、芦荟大黄素在测定范围内呈良好的相关性，具体见表2。

表2 大黄素、芦荟大黄素的线性关系、检出限和定量限

2.5.3 精密度试验

分别配制0.05、0.10、0.20 μg/mL 3种浓度的大黄素和芦荟大黄素的对照品溶液进样6次，连续3 d，得到峰面积，根据标准曲线计算，得到上述溶液的浓度并计算得到RSD值，测得结果：(0.049 1±0.000 7)、(0.100 9±0.001 6)、(0.201 4±0.001 9)μg·mL-1，其日内精密度范围分别为0.938 8%～1.624 5%、0.722 8%～1.532 2%；日间精密度范围分别为1.456 6%～1.986 2%、0.902 9%～1.842 4%。

2.5.4 稳定性试验

按“2.4”项下方法制备溶液，于0、4、8、16、24 h进样测定，得到峰面积，根据标准曲线计算含量和RSD值。大黄素、芦荟大黄素的RSD值分别为3.68%(n=6)、2.00%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.5 重复性试验

精密称取6份狗皮膏，按“2.4”项下制备狗皮膏供试品溶液，分别进样测定，计算含量和RSD值。狗皮膏中大黄素、芦荟大黄素的RSD值分别为1.62%(n=6)，1.40%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.5.6 加样回收率试验

取自制狗皮膏，精密称定9份质量均为10.00 g的狗皮膏，按“2.4”项下方法制备出狗皮膏供试品溶液，3份为一组，分别精密加入大黄素、芦荟大黄素对照品适量，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”和“2.2”项下色谱和质谱条件分别进样分析，计算加样回收率和RSD值。大黄素、芦荟大黄素平均加样回收率分别为98.8%、99.0%，RSD分别为1.1%、0.8%。

2.6 样品含量测定

按“2.4”项下方法制备供试品溶液，取对照品和供试品溶液适量，在“2.1”和“2.2”项下条件进行分析，采用UPLC-MS进样分析测定，每批样品测定6次取平均值。结果，采用上述液相-质谱条件检测狗皮膏中大黄素、芦荟大黄素的含量，测得大黄素含量为(5.836±0.002 5)μg/g，芦荟大黄素的含量为(2.049 4±0.006 8)μg/g。

3 讨论

查阅文献发现，2020年版《中国药典》未收录关于狗皮膏中成分的含量测定内容。多位学者对狗皮膏用药安全性进行考察，发现狗皮膏的生产现状存在一定差异，且潜在毒性靶器官为肾脏[6-10]。针对目前安全性研究尚不完善且含量测定内容较少的情况，有学者开展狗皮膏的含量测定实验，黄惠琼[11]等采用气相色谱对不同厂家的狗皮膏进行分析，发现不同厂家质量不均一、指纹图谱相似度低。王森[12]选择粉末入药的丁香、肉桂，建立HPLC法测定丁香酚、桂皮醛等两种成分的含量。本实验首次使用UPLC-MS/MS法测定经油炸入药的大黄活性成分大黄素、芦荟大黄素的含量。

狗皮膏属于传统剂型黑膏药的一种，制作时中药材经过高温油炸，药物化学成分结构易发生变化，经过前期课题组研究，大黄素、芦荟大黄素等两种大黄蒽醌类成分结构相对稳定且含量较多，故选择作为成分标记物，并对其进行检测。通过本次实验，建立两种成分的体外分析方法并进行方法学考察，应用该方法进行含量测定，进而分析经过高温油炸、下丹成膏等特殊工艺的两种成分含量，为后续研究奠定基础。

由于前期实验中分析时选取甲酸水-乙腈为流动相，本次实验首先考察甲酸水，使用WATERS ACQUITY BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色谱柱。结果表明，在使用甲酸水为流动相时，峰型较宽，初步推测可能目标化合物未能更好地电离。当选择易让目标化合物失电子的乙酸水-乙腈为流动相时，采用相同的色谱方法，化合物得到很好的分离，峰形尖锐且对称。因此，选取乙酸水-乙腈为流动相。

采用灵敏度高、效率高、检测限低的UPLC-MS/MS进行检测，检测器的离子利用率可达到100%，重复性、灵敏度及准确度高于离子阱。结果表明，这种方法的专属性良好；定量限和检测限、日间及日内精密度、重复性、稳定性均符合要求；并进行了加样回收率的检测，结果较好。说明该方法可以作为狗皮膏中大黄素、芦荟大黄素的含量测定，为狗皮膏之后的分析奠定方法学基础。

4 结论

本研究采用UPLC-MS/MS法测定狗皮膏中大黄蒽醌类的含量，大黄素含量为(5.836±0.002 5)μg/g，芦荟大黄素的含量为(2.049±0.006 8)μg/g。制备对照品溶液并根据建立的UPLC-MS/MS方法进样分析，得到的MRM色谱图。在ESI+和ESI-模式下，采用MRM对其含量进行检测，其中大黄素含量最高，芦荟大黄素次之，为后续研究提供了实验依据。