基于肠道菌群探讨清肠栓治疗UC的作用机制

温红珠，戴小玲，林江

(上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种慢性自身免疫性疾病，以腹痛、腹泻、黏液脓血便为主要临床表现；属于炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)的一种。随着社会经济的发展，人们饮食结构及生活习惯的改变，UC的发病率逐年上升。研究者预测至2025年，中国IBD患者人数将达到150万人[1]。UC迁延难愈，世界卫生组织将其定为难治性疾病。清肠栓是上海中医药大学附属龙华医院的院内制剂，具有清热除湿，活血化瘀止血的功效，主要由青黛、三七、马齿苋等药物组成。前期研究表明清肠栓治疗轻中度UC的临床有效率高达91.49%[2]，最近的机制研究[3]发现清肠栓治疗UC与下调肠道TLR4表达，抑制NF-κB 活化有关。本实验通过葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)造模大鼠粪菌液灌肠以及菌株体外培养的方法，探讨清肠栓对于紊乱肠道菌群是否有直接调节作用，并探讨其与NF-κB通路的关系。

1 实验材料

1.1 菌株

两歧双歧杆菌(编号：1.5029)和多形拟杆菌(编号：1.5132)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。

1.2 实验动物

健康雄性SPF级Sprague-Dawley大鼠24只，4～6周龄，体质量(200±20)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证编号为SCXK(沪)2017-0005。饲养于复旦大学实验动物科部SPF级动物房。

1.3 实验药物

DSS购自MP公司，分子质量:36 000～50 000，产品货号:160110。清肠栓组方煎剂主要组成：马齿苋、五倍子、青黛、三七。由龙华医院药剂科提供，高压蒸汽灭菌后备用。模型粪菌液：将DSS造模成功大鼠新鲜粪便置于无菌药碗中，根据相关参考文献[4]按照1∶6(W∶V)的比例加入无菌0.9%生理盐水进行初步均质加工；接着使用无菌压舌板搅拌5 min后静置5 min；然后逐级经过2层、4层、8层无菌纱布过滤以去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质，得到粪菌液，转至-30 ℃保存，1周内使用。清肠栓粪菌液：清肠栓组方煎剂高压蒸汽消毒后使用，将新鲜获得的DSS造模大鼠粪便按照1∶6(W∶V)比例加入煎剂，搅拌混匀，逐层滤过后，转至-30 ℃保存，1周内使用。

1.4 主要试剂及仪器

数码凝胶成像系统GBOX/CHEMI-XT4(英国Syngene公司)，包埋机(德国LEICA公司)，自动脱水机(德国LEICA公司)，切片机(德国LEICA公司)，高压蒸汽灭菌器(日本SANYO公司)，低温冰箱(日本SANYO公司)，OLYMPUS-ix71显微镜(日本OLYMPUS公司)，伊红及苏木素试剂(批号：140410，上海亿欣生物科技有限公司)，兔抗β-actin多克隆抗体(批号：#8457，Cell Signal Technology)，兔抗鼠TLR4多克隆抗体(批号：990394W，Bioss公司)，兔抗鼠NF-κB多克隆抗体(批号：#8242，Cell Signal Technology)。血平板(批号：20200912，上海科马嘉生物有限公司)，培养箱(赛默飞二氧化碳培养箱)。

2 实验方法

2.1 动物分组及模型制备

将24只动物适应性饲养1周后称重，根据体质量由小到大编号，采用SPSS 21.0统计分析软件，按照动物体质量进行随机分组，将动物分至以下4组：正常组(N)、DSS造模组(M)、模型粪菌液灌肠+DSS造模组(M1)、清肠栓粪菌液灌肠+DSS造模组(M2)。DSS模型制备：称取适量的DSS加入双蒸水，摇晃混匀溶解，制成5%(W/V)溶液，现配现用；给予大鼠自由饮用7 d造模，期间禁水不禁食。

2.2 给药方法

经肛灌肠，动物灌肠前12 h禁食不禁水。将大鼠四肢及头部固定在模板上，使用胶皮管，插入大鼠直肠约5 cm，用注射器缓慢注入37 ℃左右的粪菌液/生理盐水，灌完后拔出，夹子夹闭大鼠肛门；随后将大鼠倒置15 min。

2.3 样本的采集及制备

给予大鼠戊巴比妥钠(0.5 mL/100 g)腹腔注射深度麻醉后，腹部朝上置于无菌纸上，四肢固定，以75%乙醇擦拭腹部皮毛后自腹中部剪开皮肤，充分暴露腹壁，剪取肛门至回盲部的全部结肠，首先使用小镊子分离清除掉结肠表面的脂肪组织，然后使用小剪刀沿肠系膜边缘纵行剪开结肠，多次置于0.9%的冰生理盐水中涮洗干净，最后将结肠平展于滤纸上吸干水分，留取大约2 cm长度的远端结肠(组织，轻轻平展于滤纸上，以大头针固定两端，置于4%甲醛溶液固定。剩余结肠置于液氮中速冻后在-80 ℃保存，备Western blot检测用。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 血平板菌落计数

3.1.1 两歧双歧杆菌计数

菌株复苏后，置于血平板培养48 h；然后分别取2.5%、5%、10%清肠栓组方煎剂、清肠栓组方煎剂原液和纯水各10 mL，加入两歧双歧杆菌制成含108菌液，使用接种环在血平板上涂10 μL的菌液，置于培养箱中培养48 h后计数。随着煎剂浓度的增加，两歧双歧杆菌的菌落数亦见升高；与纯水培养组相比较，清肠栓组方煎剂原液培养组的两歧双歧杆菌的菌落数出现具有统计学意义的升高(P<0.01)，见表1。

表1 各浓度清肠栓组方煎液的菌落计数

3.1.2 多形拟杆菌计数

菌株复苏后，置于血平板培养72 h；然后分别取2.5%、5%、10%清肠栓组方煎剂、清肠栓组方煎剂原液和纯水各10 mL，加入多形拟杆菌制成含108的菌液，使用接种环在血平板上涂10 μL的菌液，置于培养箱中厌氧培养72 h后计数。随着煎剂浓度的增加，多形拟杆菌的菌落数亦见升高；与纯水培养组相比较，清肠栓组方煎剂原液培养组的多形拟杆菌的菌落数均见具有统计学意义的升高(P<0.01)，见表2。

表2 各浓度清肠栓组方煎液培养组的菌落计数

3.2 动物疾病活动指数

从造模第1天开始，每日观察并记录大鼠的毛色、精神状态、活动度、粪便性状、隐血及肉眼血便等情况，按照相关参考文献[5]表3进行疾病活动指数(Disease activity index,DAI)评分，根据体质量下降、粪便性状及隐血情况评分计算每只大鼠的DAI值，以评估其疾病活动情况。

表3 DAI评分标准

给药7 d后，与模型粪菌液灌肠+DSS造模组比较，清肠栓粪菌液灌肠+DSS造模组间的DAI评分出现下降趋势(P>0.05)。与DSS造模组比较，清肠栓粪菌液灌肠+DSS造模组间的DAI评分升高趋势(P>0.05)，见表4。

表4 各组DSS大鼠DAI评分的比较(分)

3.3 结肠组织病理学观察

制备结肠组织石蜡切片，进行HE染色，在光学显微镜下观察大鼠结肠黏膜情况，并参照DIELEMAN等人[6]的组织学损伤评分(histological index,HI)表评估结肠损伤情况评分。与DSS造模组相比较，模型粪菌液灌肠+DSS造模组大鼠的HI评分显著升高(P<0.05)，清肠栓粪菌液灌肠+DSS造模组大鼠的HI评分出现下降趋势(P>0.05)。与模型粪菌液灌肠+DSS造模组相比，清肠栓粪菌液灌肠+DSS造模组大鼠的HI评分显著下降(P<0.01)，见表5。

表5 各组大鼠HI评分的比较

3.4 结肠TLR4、NF-κB表达的测定

从各组大鼠结肠标本中随机选取3个样本并提取组织总蛋白，采用BCA蛋白定量法测定浓度，制备胶，启动凝胶电泳(100 V/90 min)转膜后加入一抗、二抗进行孵育，凝胶成像系统显影，应用图象分析系统分析底片中的目的条带，计算机自动读取并记录每条带的密度值。与正常组相比较，DSS组、模型粪菌液灌肠+DSS造模组大鼠的结肠TLR4/NF-kB显著升高(P<0.01)；与DSS组比较，模型粪菌液灌肠+DSS造模组大鼠的结肠TLR4显著升高(P<0.05)、NF-kB升高(P>0.05)，清肠栓粪菌液灌肠+DSS造模组大鼠的结肠TLR4/NF-kB下降(P>0.05)；与模型粪菌液灌肠+DSS造模组比较，清肠栓粪菌液灌肠+DSS造模组大鼠的结肠TLR4/NF-kB显著下降(P<0.05)，见表6、图1。

表6 各组DSS大鼠结肠TLR4、NF-κB的比较

注：N.正常组；D.DSS造模组；M.模型粪菌液+DSS造模组；Q.清肠栓粪菌液+DSS造模组。图1 各组大鼠结肠TLR4和NF-kB蛋白表达

4 讨论

UC是炎症性肠病的一种，属于自身免疫性疾病，其病因复杂多样，目前主要认为与免疫、遗传和环境等多种因素相关。UC临床症状以腹痛、腹泻、黏液脓血便为主，组织病理学检查主要表现为黏膜及黏膜下层炎症和溃疡形成。中医学虽然没有UC病名，但根据历代医籍中记载的“肠澼”“下利”“久痢”“休息痢”“滞下”等对病名的解释以及对其临床表现的描述，我们不难将这些病名与UC联系起来。

清肠栓是上世纪八十年代中期，上海中医药大学附属龙华医院上海市名老中医马贵同教授在中医理论指导下，结合多年的临床与科研经验，针对国人UC发病的主要病理因素及发病特征，抓住湿、热、毒、瘀四个主要病邪，以清热除湿、活血化瘀为治疗法则，同时根据传统疮疡科制剂的用药特点，选用青黛、三七、马齿苋等中药制成的直肠给药制剂。方中马齿苋酸寒无毒，归肝、大肠经，有清热解毒、除湿止痢、凉血止血之功。《本草纲目》记载:“散血消肿，利肠滑胎，解毒通淋”。青黛归肝、肺、胃经，性咸寒，长于清热解毒，用于清肠胃之邪热，力专而效宏；《本草正义》有青黛“治瘟疫热毒发狂……痈疡肿毒”的记载。三七甘微苦温无毒，善止血活血定痛，祛腐生肌；能通亦能补；具有止血不留瘀血，行血不伤新的优点，《本草纲目》记载其能治疗“赤痢血痢”。五倍子酸平无毒，归肺、大肠、肾经，涩肠止血，解毒止泻之功。《本草纲目》记载其可疗“泻痢不止”“脾泻久痢”。全方以马齿苋、青黛清热解毒，除湿愈溃，共为君药；三七活血化瘀、祛腐生肌，并止血而不留瘀，为臣药；五倍子收敛固涩，助青黛、三七收敛溃疡疮口而不留邪，为佐使药。

肠道菌群是指在人体肠道中与人体共生的微生物，肠道菌群紊乱是近年来有关UC病因的研究热点。正常情况下，肠道内有大量的免疫细胞，使肠道处于一种“生理性”的慢性炎症状态；UC患者的这种调控过程出现异常，肠道黏膜免疫功能失调，这种黏膜免疫系统的慢性激活可能是对某种感染因子的适度反应，但至今尚未找到这样一种感染因子，且UC高发的国家的感染性肠病的发病率却很低。所以，目前主要认为UC的发病是针对机体肠道菌群的过度免疫应答引起的一种病理性炎症状态。肠道菌群在UC中的作用，并不表现为某种特定的肠道微生物引起疾病，而是作为一个整体，通过改变肠道微生态的稳态参与UC的发生发展[7]；有研究发现肠道菌群参与UC的机制可能与TLR/NF-κB信号通路过度激活有关[8]。本研究发现DSS造模大鼠粪菌结构与正常大鼠不同，这与2012年SAMANTA等人[9]的研究结果一致。而在DSS造模同时，给予DSS造模动物的粪菌液灌肠可上调DSS造模大鼠结肠TLR4、MYD88和NF-κB蛋白表达，这表明肠道菌群紊乱对NF-κB通路过度激活可能确实有促进作用。

两歧双歧杆菌和多形拟杆菌均属于益生菌，研究表明两歧双歧杆菌[10]和多形拟杆菌[11]均可诱导DSS结肠炎缓解，其作用机制与调节DSS模型的肠道微生态失调，抑制NF-κB信号通路和促炎细胞因子表达等有关。本研究采用体外研究发现清肠栓有促进两歧双歧杆菌和多形拟杆菌生长的作用。而动物研究发现与DSS造模+模型粪菌液灌肠组比较，予清肠栓煎剂干预处理后的模型粪菌液灌肠，则动物的HI评分显著下降，DAI有下降趋势。但与DSS造模组相比的HI评分和DAI评分则仅有下降趋势，表明清肠栓组方治疗UC可能与促进了肠道菌群紊乱的恢复有关。进一步的机制研究发现，在DSS造模同时，给予动物模型粪菌液灌肠或清肠栓煎剂干预处理后的模型粪菌液灌肠，清肠栓粪菌液灌肠组大鼠结肠组织的TLR4和NF-κB蛋白表达与模型粪菌液灌肠组比较，均出现显著下降，表明清肠栓可能通过调整肠道微生态平衡，进而抑制NF-κB通路的过度激活，抑制炎症细胞因子分泌，从而起到治疗UC的作用。