急性脑血管病致多器官功能障碍综合征心率变异性及乙酰胆碱、内毒素表达研究

崔瑶瑶 戴宏伟 贺燕 郭洪志

【摘要】目的：动态监测急性脑血管病（ACVD）致多器官功能障碍综合征（MODS）患者乙酰胆碱（Ach）、内毒素表达及心率变异性（HRV）、急性生理及慢性健康状况评分（APACHEⅡ），并与腔隙性脑梗死患者对比分析，探讨ACVD致MODS时Ach、内毒素、交感-迷走神经功能的变化规律，及其与疾病严重程度的关系。方法：筛选ACVD致MODS患者（MODS组）、腔隙性脑梗死患者（腔梗组）各30例，分别于发病（入组）24h、72h、7d、14d空腹取血送检，采用酶标记免疫吸附法检测Ach的含量，改良基质显色法鲎试验测定内毒素含量;60例受试者各时相点评定HRV、APACHEⅡ，对比分析。结果：MODS组各时相点内毒素、APACHEⅡ评分、HRV的低/高频段功率比（LF/HF） 均显著高于腔梗组（P<0.01）;MODS组各时相点低频段功率（LF）、高频段功率（HF）均显著低于腔梗组（P<0.01）;MODS组内毒素、LF/HF、与APACHEⅡ评分呈正相关。Ach与APACHEⅡ评分呈负相关。结论：ACVD致MODS患者均出现严重的内毒素血症、交感-迷走神经张力失衡。內毒素血症是导致疾病严重程度加重的主要因素，而迷走神经胆碱能系统在ACVD致MODS时发挥了潜在的保护作用。

【关键词】急性脑血管病;多器官功能障碍综合征;心率变异性;乙酰胆碱;内毒素

基金项目：山东省自然科学基金（NO.ZR2015HL120） 济南市临床医学科技创新计划（202019191））

Abstract：Objective By the continuous detection of acetylcholine（Ach）， endotoxin， heart rate variability （HRV） and the scores of acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ（ APACHE Ⅱ） in patients with multiple organ dysfunction syndrome （MODS） induced by acute cerebrovascular disease （ACVD） ， and the compare those indicators with patients of lacunar infarction people， make clear the changing rules of Ach， endotoxinand the Sympathetic-vagus nerve function and their relations with severity of diseases. Methods  A total of 30 patients with ACVD-induced MODS （MODS group） and 30 patients with lacunar cerebral infarction （luminal infarction group） were screened. Take blood on empty stomach respectively in 24h， 72h， 7d and 14d. Detect the expression of Ach by adopting the enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Determine the serum endotoxin by using improved substrate chromogenic limulus test. Make assessments and analyse comparatively the results of HRV， APACHE Ⅱ at every time point of the 60 subjects. Results  Compared with lacunar infarction group at every time point， the levels of endotoxin，Ach ， APACHEⅡ and HRV named by low/high frequency power ratio （LF/HF）in MODS group were significantly higher（P<0.01）; The low frequency power （LF） and high frequency power （HF） in MODS group were significantly lower than those in lumen obstruction group （P < 0 01）. There was a positive correlation between endotoxin， LF/HF and APACHE Ⅱ score in MODS group. The levels of Ach were negatively correlated with APACHEⅡscore. Conclusion  All patients with ACVD induced MODS developed severe endotoxemia and sympathetic - vagal tone imbalance.Endotoxemia is a major factor leading to disease severity and the vagal cholinergic system plays a potential protective role in ACVD induced MODS.

Keywords：Acute cerebrovascular disease; Multiple organ dysfunction syndrome;  heart rate variability;endotoxin; acetylcholine

神经内分泌的改变在急性脑血管病（acute cerebrovascular disease，ACVD）导致多器官功能障碍（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的病程进展中起重要作用。ACVD发生时下丘脑等高级神经中枢可通过延髓内脏带-迷走神经通路对周围脏器功能进行调控，其中的胆碱能抗炎通路即由迷走神经及其主要递质乙酰胆碱（acetylcholine， Ach）形成，而且该抗炎通路可能在MODS时对周围脏器具有保护作用但具体机制尚未完全明了。本研究篩选ACVD致MODS患者、腔隙性脑梗死患者各30例，通过连续测定各时相的外周血内毒素、Ach的含量、心率变异性（HRV）及急性生理及慢性健康状况评分（APACHEⅡ），研究上述指标在ACVD致MODS发生时的相关性，探索胆碱能抗炎通路在ACVD致MODS患者病程中的可能调控机制。

1、临床资料

1.1. 分组：本研究受试者共60例，分为2组：MODS组、腔梗组各30例。

MODS组：筛选2015年7月-2018年2月山东中医药大学第二附属医院神经内科、神经外科收治的ACVD致MODS患者30例，其中男性18例，女性12例，平均年龄56.58±11.59岁;脑出血3例，脑梗死27例。

腔梗组：筛选2015年7月-2018年2月山东中医药大学第二附属医院神经内科收治的腔隙性脑梗死患者30例，其中男性17例，女性13例，平均年龄54.81±10.13岁。

以上2组患者的年龄、性别无显著性差异（P均>0.05）。

1.2诊断标准：符合急性脑血管病诊断标准与中华医学会全国脑血管病会议在1995年制定的脑梗死、脑出血、蛛网膜下腔出血的诊断标准;SIRS诊断标准与美国胸科医师学院和心脏重症医学会协作会议在1991年提案的SIRS的临床标准一致;MODS诊断及分期与庐山全国危重病急救医学学术会议在1995年设定的《多脏器功能障碍综合征（MODS）病情分期诊断及严重程度评分标准》相一致。

1.3入组标准：符合ACVD致MODS的诊断标准;发病在24h以内;入组者自愿参与本研究同时签署知情同意书（无行为能力者由监护人同意并签署）。

1.4排除标准：本次发病前即患有重大疾病如严重心、脑、肺、肝、肾、胃肠功能障碍、严重血液病、重症感染等;3个月内参与过其他临床试验。

1.5剔除标准：出现严重不良事件而不能将本研究方案继续者;受试者不配合本研究方案不能确信完成本研究者。

2、观察指标及方法

MODS组和腔梗组受试者分别于发病24h、72h、7d、14d 4个时相点采集清晨空腹肘静脉血15ml。10ml置于抗凝试管中2000r/min离心10min，分别吸取上层血清，置-80℃冰箱冷冻保存。采用改良基质显色法鲎试验测定内毒素含量，酶标记免疫吸附法（ELISA）检测Ach的含量。60例受试者分别于发病/入组24h、72h、7d、14d4个时相点测定心率变异性（HRV），指标包括：低频段功率（LF）、高频段功率（HF）、低/高频段功率比（LF/HF）、急性生理和慢性健康评分Ⅱ（The Acute Physiology and Chronic Health EvaluationⅡ，APACHEⅡ）。

3、统计学方法

试验数据用均数±标准差 （X±S） 表示，应用SPSS17.0统计软件包进行处理，组间差异显著性检验采用方差分析及多重相关分析，组内比较采用配对t检验，以P<0.05为差异有显著意义。

4、结果

4.1 MODS组与腔梗组相比：MODS组内毒素含量、APACHEⅡ评分显著高于腔梗组（P<0.01）;Ach表达72h显著高于、24h和14d显著低于腔梗组（P均<0.01）;HRV的LF和HF显著低于、LF/HF 显著高于腔梗组（P均<0.01）。（见表1-4）

4.2以各组APACHEⅡ评分为因变量（Y），以内毒素（X1）、LF/HF（X2）、Ach（X3）为自变量做偏相关分析显示：Ach与APACHEⅡ评分测定值呈负相关，偏相关系数为-0.102;内毒素与APACHEⅡ评分测定值呈正相关;HRV评分与APACHEⅡ评分测定值偏相关系数为0.054，相关性低。各指标与APACHEⅡ评分相关及偏相关系数见表5.

5、讨论

目前关于MODS的发病机制存在多种假说，其中肠道细菌易位、内毒素和炎症失控假说已经被广泛认可， 诸多证据显示内毒素（endotoxin）即脂多糖（lipopolysaccharide， LPS） 是最重要的触发因子。各种创伤应激时人体肠粘膜屏障破坏导致肠道细菌易位和内毒素血症的发生，肠道内细菌、内毒素进入体循环后，通过表达上调的内毒素受体 CD14 系统激活多种炎症细胞及活化体液径路（如补体、凝血系统），刺激组织产生多种免疫反应，进而出现瀑布效应诱发全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）;另一方面因肠黏膜通透性增加及细菌易位，使肠腔微生物及其产物经门静脉入肝，刺激肝窦内皮细胞、Kuffer 细胞与肝细胞释放多种炎症介质，使炎症反应不断加重，诱发SIRS，导致 MODS 的发生。内毒素异常表达在该过程中处于核心地位，而且其可能对炎性因子具有增敏作用。脂多糖结合蛋白（lipolysaccharide binding protein ，LBP）的 N 末端与 LPS 的脂质 A 发生特异性的结合后， LPS 向 CD14转递炎性信号，而CD14通过体液免疫及激活炎性细胞启动级联反应，促使MODS进一步发展。有研究显示，LPS 具有对内皮细胞等非髓样细胞损伤的作用，并且其依赖于可溶性CD14（soluble CD14， sCD14）的参与，sCD14是内毒素的特异性受体蛋白，如果使用抗 CD14 抗体预处理，则可抑制血清依赖性的LPS对内皮细胞的激活作用，因此CD14 在介导 LPS 发挥生物学功能中发挥十分重要的作用。脑源性多器官功能障碍综合征（CMODS）发生机制和临床特点除MODS的特点外，还具有其特殊性。CMODS特别是重症患者易触发机体神经-内分泌-免疫网络调控紊乱，导致过度炎症反应，故ACVD致MODS具有发生快、病情进展迅速、病死率和致残率高的特征。本团队前期的系列实验研究最先证实缺血性脑血管病导致的CMODS存在肠道内毒素易位和血清内毒素异常升高的现象;其后发现脑出血致MODS大鼠模型存在内毒素血症和炎症因子TNF-α、IL-1在各脏器的异常表达， 提示内毒素血症刺激炎症因子TNF-α、IL-1的异常释放，诱发SIRS，导致MODS的发生;而且脑出血致MODS模型鼠除血清内毒素含量明显升高外，内毒素受体CD14 mRNA和IL-1β在肠组织表达明显增加，提示ACVD的严重打击导致肠道粘膜屏障功能破坏，内毒素易位导致内毒素血症，进而诱发炎症因子释放，导致失控的SIRS进而诱发MODS。本研究中MODS组患者各时相点内毒素含量和APACHEⅡ评分显著高于腔梗组（P<0.01），进一步证实ACVD患者发生SIRS和各脏器损害过程中持续存在严重的内毒素血症，LPS可能参与了ACVD致MODS的发生发展过程。

HRV是逐次窦性心搏之间心动周期的微小时间与频率的变异，可以反映植物神经对心血管系统的影响。HRV 的频域分析法以频域范围下面积作为定量观察指标， 定量评价交感和迷走神经活性。低频（LF）反映交感和副交感神经的双重活性;高频（HF）反映迷走神经活性，是心脏副交感神经支配的定量标志;LF/HF，反映交感神经活性。1996 年Godin 等提出了一种新的、互补的，有关MODS发病机制的假说，即相互关联器官之间的“解偶联假说”，其认为人体各相互作用器官之间的“解偶联”促进了MODS 的发展，而这种解偶联实际上是自主神经功能障碍的一种表现，并且可以通过HRV进行检测。他们给健康志愿者静脉注射内毒素，检测到可逆的HRV的减低，说明在脓毒血症时存在自主神经功能障碍，并且HRV减低是其重要特征表现。Seely 等应用非线性的分析方法来分析HRV，得出结论支持“解偶联假说”，并强调HRV的改变是MODS的病理生理特点。王蕾等使用实验性脑梗死模型，通过检测HRV评价大鼠自主神经功能，结果发现脑梗死组HRV的相邻RR间期差值的均方根、总功率谱和LF、HF较对照组降低，提示脑梗死引起心脏自主神经总活性降低、自主神经功能受损。心脏的交感和迷走神经传出信号起始于大脑，分别走行于交感干和迷走神经，然后通过去甲肾上腺素、Ach与心脏各自受体结合。心脏起搏细胞上的受体偶联触发信号通道最终可引起起搏电流并通过“特种电流”（funny current，If）传导。If 是由超极化环核苷酸门控通道（HCN）离子内流形成的电流。利用完整细胞插入钳的方法对分离的人右心房肌细胞进行实验，发现内毒素明显地损害了If。此外，在内毒素作用的心肌细胞上，β肾上腺素对If的影响更加显著。也就是说，内毒素在抑制窦房结功能的同时，β肾上腺素对窦房结的影响更加显著。这说明了为何HRV在MODS中降低，因为降低的HRV是患者自主神经功能障碍的一个重要特征，并且是预后不良、病死率增加的标志。本研究中MODS组患者各时相点LF、HF均显著低于腔梗组（P均<0.01），LF/HF均显著高于腔梗组（P均<0.01），提示ACVD致MODS患者，交感和副交感神经活动均减弱， 但交感神经活动仍占优势，即迷走神经活性处于相对较低的状态，存在交感-迷走神经张力失衡。

迷走神经分泌的Ach不仅是神经传导的主要递质， 在神经信号传导的过程中起了关键的作用，而且在神经内分泌免疫调节网络也发挥重要的作用，它和β肾上腺素共同调控交感神经和副交感神经的兴奋性，决定人体自主神经的功能状态。Ach通过迷走神经下调炎性因子TNF-α等的表达，继而SIRS得到控制乃至各种原因所导致的MODS的结局也得以改写。本团队前期实验研究也证实迷走神经可将炎症信息在中枢和外周相互传递，SIRS的降低也可通过增强迷走神经传出来实现，提示迷走神经胆碱能抗炎通路的兴奋对周围脏器具有保护作用，其机制与抑制SIRS有关。本研究中MODS组患者Ach表达72h较腔梗组高 （P<0.01）、24h和14d則显著低于腔梗组（P<0.01），说明在ACVD致MODS过程中副交感神经作用仍以抑制状态为主。本研究还显示以APACHEⅡ评分为因变量的相关分析结果中，内毒素、LF/HF与APACHEⅡ评分均呈高度正相关，Ach与APACHEⅡ评分相关性低。偏相关分析显示：内毒素对APACHEⅡ评分影响强度高，LF/HF对APACHEⅡ评分影响强度低，Ach与APACHEⅡ评分为负相关，但影响强度低，说明神经功能受损及内毒素血症对患者疾病严重程度影响最为直接，符合内毒素作为MODS过程中的始动因子的作用机制。而Ach受体可能受到内毒素抑制，β肾上腺素对心脏肾上腺素能受体的作用则更加显著，呈现副交感神经被抑制的表现，故而在MODS过程中的Ach发挥的影响较内毒素低，而HRV也因受交感神经及副交感神经功能失调的影响，在MODS过程中对疾病严重程度的影响也较低。

综上所述，本研究证实ACVD致MODS患者均出现严重的内毒素血症、交感-迷走神经张力失衡。内毒素血症是导致疾病严重程度加重的主要因素，而迷走神经及其递质Ach则表现出潜在的保护作用，进一步探寻安全有效地增强迷走神经兴奋性以增加Ach递质释放的方法可能成为ACVD致MODS临床治疗的新靶点。

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通訊作者：贺燕