HPLC-VWD-Q-TOF-MS/MS法定性与定量分析枳实栀子豉汤成分

赵 权， 张 优， 陈 影， 欧阳冰琛， 戴国梁， 居文政

(南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029)

枳实栀子豉汤源自东汉张仲景《伤寒论》393条，为医治“发汗吐下后, 虚烦不得眠”并“劳复发热”之良方[1]。全方由枳实、栀子、淡豆豉三味中药所组成。其中枳实为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种或甜橙CitrussinensisOsbeck的干燥未成熟果实[2]；归脾、胃经；理气宽中、行滞消胀；栀子为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实；归心、肺、三焦经；泻火除烦、清热利湿、凉血解毒[3]。豆豉为豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的成熟种子的发酵加工品[4]；归肺、胃经；解表，除烦，宣发郁热。三药合用，具有清热除烦、解郁安神、改善失眠的功效，临床上常用于治疗热扰胸嗝、气机不畅、郁热虚烦等症状[5-6]。

对中药复方进行定性及定量分析，是保证其质量可控和疗效稳定的重要手段。目前，已有对枳实栀子豉汤进行定性分析的文献报道，但其定性结果未检测到淡豆豉中的化学成分[7]。仅对枳实、栀子两味药材进行定性分析，分析结果具有一定的片面性，对后续可能的体内实验不能全面指示枳实栀子豉汤发挥药效的物质基础。本实验采用超高效液相-四级杆-飞行时间质谱仪(HPLC-Q-TOF-MS/MS)定性分析枳实栀子豉汤中的化学成分，以期为研究枳实栀子豉汤发挥药效物质基础的溯源提供参考。中药复方化学成分复杂，种类庞杂，使用不当可能会引起毒性作用，所以中药材相关化学成分的含量是否合格极为重要。检索相关数据库，尚未有对主成分进行同时定量分析的文献报道，本实验参考刘昌孝院士提出的中药质量标志物确定原则[8]，采用HPLC法同时测定枳实栀子豉汤方中6种成分的含量，以期为其质量标准提供技术支撑和数据支持。

1 材料

1.1 仪器 LC(美国 Agilent公司)-Triple TOF TM 5600液相色谱-质谱联用仪(美国 AB Sciex公司)，配有 PeakView(version1.2)数据处理软件和质谱自动校准调谐系统(CDS)；Waters 2695高效液相色谱仪(配置Waters 2487 紫外检测器)(美国Waters公司)；CPA 225D 电子天平(德国Sartorius公司)；Milli-Q Advantage A10超纯水机(美国Millipore公司)；Legend Micro 17R 冷冻离心机(美国Thermo公司)；KH5200E 超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；WH2 微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)。

1.2 试剂与药物 京尼平龙胆双糖苷(批号MUST-19102801)、栀子苷(批号MUST-17020401)、柚皮苷(批号MUST-17040102)、橙皮苷(批号MUST-16041806)、新橙皮苷(批号MUST-17040707)对照品(纯度≥98.00%)均购自成都曼斯特生物科技有限公司；大豆苷(批号111738-201603)对照品(纯度93.3%)购自中国食品药品检定研究院。甲醇和乙腈(色谱纯，德国 Merck公司)；甲酸(色谱纯，瑞士 Fluka-Sigma-Aldrich公司)；磷酸(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；TOF-MS 正离子调谐液(批号 4460131)、TOF-MS 负离子调谐液(批号 4460134)(美国 AB Sciex公司)。枳实(产地江西，批号171027007)、栀子(产地江西，批号180622016)、淡豆豉(产地河北，批号170531001)，均购自北京同仁堂南京分店，经江苏省中医院药学部副主任药师张倩鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件 Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)；流动相0.1% 甲酸水(A)-甲醇-乙腈(1∶1)(B)，梯度洗脱(0～1.0 min，20%～25% B；1～3.5 min，25%～30% B；3.5～4.5 min，30%～48% B；4.5～6.5 min，48%～52% B；6.5～6.8 min，52%～60% B；6.8～9.5 min，60%～65% B；9.5～10.0 min，65%～90% B；10.0～11.5 min，90% B；11.5～12.0 min，90%～20% B；12.0～15.0 min，20% B)；体积流量450 μL/min；柱温为40 ℃；进样量10 μL；进样室温度4 ℃。

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源以正负离子模式采集数据, TOF-MS 扫描模式参数设置为分子量扫描范围m/z60～1 500；累积时间 0.249 996 s; 离子化温度(TEM)550 ℃；雾化气(GS1)50 psi(1 psi=6.895 kPa); 辅助加热气(GS2)50 psi; 气帘气(CUR)35 psi; 去簇电压(DP)80 V；碰撞能量(CE)10 eV；正负离子模式下喷雾电压(ISVF)分别为5 500 V、4 500 V。采用信息关联采集(Information dependent acquisition, IDA)、智能化的动态背景扣除(Dynamic background subtraction, DBS)和高灵敏度的模式采集数据。子离子扫描模式的参数设置为分子量扫描范围m/z40～1 000；碰撞能量(35±15)eV, 其他主要参数同TOF-MS扫描模式。采用AB 公司的调谐液传递系统(CDS)对分子量准确度进行自动校准。通过AB公司的分析控制软件Analyst® TF 1.6 software控制仪器操作和数据采集。

2.1.3 定量分析色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1% H3PO4(B)，梯度洗脱(0～5 min, 2%～8% A; 5～15 min, 8%～15% A; 15～25 min, 15%～15% A; 25～35 min, 15%～20% A; 35～45 min, 20%～30% A); 检测波长254 nm;进样量10 μL; 柱温35 ℃; 体积流量1.0 mL/min。

2.2 对照品溶液制备 精密称取京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品适量，分别加甲醇制成含相应成分2.94、3.00、1.00、1.00、1.00、1.00 mg/mL的对照品贮备液，再分别吸取上述对照品适量，加甲醇配制成含相应成分30.39、79.51、6.677、173.1、44.27、139.6 μg/mL的混合对照品溶液，即得。

二是成立行动领导工作组。为提高工作认识，落实责任主体，成立由局长任组长，班子成员为副组长，各业务股室负责人为成员的工作组。同时，领导工作组下设业务小组，由分管领导为小组长，采购办、财检办、行政政法股、科教文股、农财股、经建股、乡财股、社保股、综合股各派一名人员组成。

2.3 供试品溶液制备 将枳实15 g、栀子12 g、淡豆豉10 g放入1 L圆底烧瓶中，第一次加入10倍量的75%乙醇回流提取2 h，滤过，第2次加入8倍量的75%乙醇回流提取1 h。合并2次滤液，浓缩为1.332 g/mL的质量浓度，待用。精密吸取1 mL浓缩液于25 mL锥形瓶中，加入50%甲醇定容，摇匀，即得。

2.4 质谱分析 通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)和相关文献检索各中药材所含的化合物，根据PubChem Compound、ChemSpider获得化合物分子式、分子量，查阅相关文献，收集各化合物在正、负离子模式下的分子离子峰与二级碎片离子峰。PeakView软件分析其总离子流图，正、负离子总离子流图见图1。鉴定结果见表1。标准品二级质谱裂解图见图2。有标准品的化合物，则通过标准品进行比对。共鉴定出38个化合物。包括枳实15个化合物、栀子14个化合物，淡豆豉10个化合物，1个化合物为栀子和淡豆豉共有。主要包含环烯醚萜类、黄酮苷类、异黄酮苷类、有机酸类、黄酮类和异黄酮类。同一类型化合物具有相似的断裂方式。

图1 枳实栀子豉汤总离子流图

表1 枳实栀子豉汤各化学成分鉴定分析结果

图2 标准品二级质谱图

2.4.1 环烯醚萜类 鉴定出的环烯醚萜类化合物均来源于栀子。以栀子苷(11)为例，通过PubChem Compound查询其分子式C17H24O10，分子量388，在负离子模式下，碎片离子峰中有较强的m/z433的碎片离子峰，根据其碎片峰的质荷比，推测m/z433的碎片离子峰为[M+HCOO]-，可能是栀子苷。二级碎片离子m/z225[M-H-glc]-是由准分子离子峰[M-H]-脱去一分子中性碎片葡萄糖(162 Da)产生的，m/z225进一步发生RDA裂解，产生m/z123[M-H-Glc-C4H6O3]-的碎片离子峰。见图3。

图3 栀子苷质谱裂解过程

2.4.2 黄酮苷类 以柚皮苷(16)为例，柚皮苷为二糖苷类化合物，所含配糖基由鼠李糖与葡萄糖组成。正离子模式下，在一级质谱中显示分子离子峰为[M+H]+m/z581，二级质谱中出现m/z435和m/z273的碎片离子峰。根据其化合物结构，m/z435为柚皮苷末端丢失中性碎片鼠李糖(146 Da)的碎片离子峰；m/z273为柚皮苷丢失整个糖基所得的碎片离子峰。其过程见图4。柚皮芸香苷等其他黄酮苷有着相似的断裂方式。具体碎片信息见表1。

图4 柚皮苷质谱裂解过程

2.4.3 异黄酮苷类 以大豆苷(12)为例，大豆苷化合物名称为大豆苷元-7-O-葡萄糖苷，其结构是大豆苷元色原酮结构7号位通过氧苷键连接了葡萄糖形成的异黄酮苷类化合物。在负离子模式下，一级质谱中分子离子峰为[M-H]-m/z415。二级质谱可观察到丰度较高的m/z252[M-H-Glc]-的碎片离子峰。鉴定出的异黄酮苷类大部分来源于淡豆豉，对染料木苷、黄豆黄苷等异黄酮苷类化合物也进行相应的鉴定。裂解过程见图5。

图5 大豆苷质谱裂解过程

2.4.4 有机酸类 以绿原酸(10)为例，在PubChem查询其分子量后，推测其[M+H]+和[M-H]-分别为m/z355和m/z353。分别在正、负离子总离子流图中找到相对应的分子离子峰，并核对其保留时间是否一致。在负离子模式下找到分子离子峰m/z353[M-H]-。其二级质谱中包含文献中报道的m/z191[M-H-C9H6O3]-和m/z173[M-H-C9H6O3-H2O]-的碎片离子峰。在正离子模式下找到分子离子峰m/z355[M+H]-。对应的二级质谱中找到m/z163[M+H-C7H11O6]+的碎片离子峰，推测是由准分子离子峰脱去一分子奎尼酸所得，继续脱掉一个CO得到m/z135[M+H-C7H11O6-CO]+的碎片离子峰。其具体裂解过程见图6。

图6 绿原酸在正、负离子模式的质谱裂解过程

2.4.5 黄酮类 以橘皮素(38)为例，在正离子模式下，根据橘皮素分子量推测m/z373是其分子离子峰。在二级质谱中找到m/z343[M+H-2CH3]+，m/z211[M+H-C10H10O2]+的碎片离子峰。与文献[10]报道一致，因此确证橘皮素的存在。

2.4.6 异黄酮类 以大豆苷元(25)为例，负离子模式下，根据其分子量，推测m/z253应为其分子离子峰[M-H]-。二级质谱峰分别为224[M-H-CHO]-，208[M-H-CHO-CO2]-，133[M-H-C7H6O2]-。结合其参考文献[11]，推测可能是大豆苷元。

2.5.1 专属性试验 在“2.1”项色谱条件下，取适量对照品、供试品溶液，精密吸取10 μL进样分析。结果见图2。由此可知，各物质分离度良好，京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷保留时间分别为12.37、14.55、17.94、33.78、35.65、37.92 min，分离度良好，色谱峰附近无其他成分的干扰，专属性强，色谱图见图7。

1.京尼平龙胆双糖苷 2.栀子苷 3.大豆苷 4.柚皮苷 5.橙皮苷 6.新橙皮苷

2.5.2 线性关系考察 精密量取“2.2”项下对照品储备液适量，倍比稀释成6个不同质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样10 μL测定。以峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)进行回归，结果见表2，可知各成分在各自线性范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.5.3 精密度试验 吸取“2.2”项下对照品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下测定，连续进样6次。测得京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面积RSD分别为0.70%、0.55%、0.35%、0.46%、0.92%、0.26%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 按“2.3”项下方法制备供试品溶液，室温下于0、1、2、4、8、12、24 h，在“2.1”项色谱条件下测定，测得京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面积RSD分别为1.76%、0.80%、1.72%、0.99%、1.53%、0.88%，表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

2.5.5 重复性试验 按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在2.1”项色谱条件下进样，测得京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、大豆苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量RSD分别为0.91%、0.97%、1.06%、0.93%、1.01%、0.88%，表明该方法重复性良好。

2.5.6 加样回收率试验 按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，测定其含量，加入适量对照品贮备液，在2.1”项色谱条件下进样，计算回收率，结果见表3。

表3 各成分加样回收率试验结果(n=6)

2.5.7 样品含量测定 按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液，平行3份，在“2.1”项色谱条件下测定含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果(mg/g，n=3)

3 讨论

3.1 HPLC-Q-TOF-MS/MS定性分析 在流动相中，添加0.1%甲酸有利于黄酮类成分的峰形改善，也有利于某些成分如栀子苷产生响应更好的[M+HCOO]-分子离子峰。TOF-MS定性过程中发现，文中涉及到3组同分异构体(橙皮苷与新橙皮苷、橙黄酮与异橙黄酮、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、鸡屎藤次苷甲酯与羟异栀子苷)。有些同分异构体如橙皮苷与新橙皮苷，其分子离子峰一致，但其色谱行为不一致，因此在建立方法时，根据标准品的出峰时间，调整梯度使其在不同时间出峰，并比对标准品的二级碎片离子峰来进行鉴定。橙黄酮与异橙黄酮分子离子峰一致，可以根据出峰时间顺序进行鉴定和区别[18]。文中还有一些同分异构体如去乙酰基车叶草苷酸甲酯、鸡屎藤次苷甲酯与羟异栀子苷没有标准品，因此，需要根据其出峰时间结合二级碎片离子峰加以判断[16, 19-20]。

3.2 定量分析

3.2.1 成分选择 枳实中的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷；栀子中的栀子苷；淡豆豉中的大豆苷等异黄酮类成分均具有抗抑郁的作用[21-23]。与方剂中解郁安神的功效基本一致。栀子中除2015年版《中国药典》所规定的栀子苷作为指标性成分外，再增加一个药材专属性强且性质稳定的京尼平龙胆双糖苷作为栀子的指标性成分。

3.2.2 色谱条件优化 比较Waters Xterra MS C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Waters Symmetry C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)3种色谱柱，最终选择Agilent ZORBAX SB-C18柱。通过比较乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水和甲醇-乙腈-0.1%磷酸水4种流动相，结果发现乙腈-0.1%磷酸水作为流动相时峰形最优。实验初期分别在238、246、254、270、283 nm进行检测波长的比较。发现在254 nm条件下，分析物附近的杂峰较少，对于分析物的分离更有利。

3.2.3 进样溶剂选择 考察了纯甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、纯水作为进样溶剂，发现50%甲醇作为进样溶剂时各分析物分离良好，峰形最优。

本实验应用HPLC-Q-TOF-MS/MS联用技术，通过高分辨率质谱获得化合物精确分子量、保留时间、碎片离子峰等信息，共鉴定出38个化合物。应用HPLC-VWD高效液相色谱法，建立了枳实栀子豉汤中6种成分同时测定的定量方法。对中药复方进行定性及定量分析，以期为综合评价枳实栀子豉汤的质量提供参考，为阐明其药效物质基础提供科学依据。