UPLC-ESI-MS法分析盆炎清栓主要成分

胡雪黎， 文德鉴， 涂 星， 杨士林， 杨 宝， 胡泽华,3*

[1.风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室(湖北民族大学)，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大学医学部，湖北 恩施 445000；3.湖北民族大学武陵山中药材检验检测中心，湖北 恩施 445000]

盆炎清栓收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》，是由吲哚美辛和毛冬青提取物组成的复方制剂，具有清热解毒、消肿止痛的功效，主要用于治疗盆腔炎等疾病[1]，能显著降低抗生素的耐药性和盆腔炎的复发率[2-3]。但目前相关文献仅报道了采用RP-HPLC法测定盆炎栓中吲哚美辛含量[1,4]，以及采用TLC法对该制剂中毛冬青提取物进行定性鉴别[1]，而盆炎清栓化学成分复杂，药效发挥可能是多成分协同作用的结果，故仅测定上述指标无法全面控制其质量。

中药及其复方制剂的化学成分研究主要是采用传统的色谱法分离，再通过核磁共振波谱法鉴定结构，虽然所得结果较准确，但实验周期长，鉴定化合物少，难以快速全面地对其进行表征。超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q/TOF-MS/MS)是一种结合了高效分离和高通量定性、定量的技术，已广泛应用于中药成分分析[5]。因此，本实验首次采用UPLC-Q/TOF-MS/MS法鉴定盆炎清栓化学成分，并测定芦丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、吲哚美辛、冬青素A的含量，以期为该制剂质量控制和药效物质基础研究提供参考。

1 材料

LC-30A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；AB Sciex TripleTOF5600+质谱仪、PeakView 2.0软件(美国AB Sciex公司)；ME104电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；TG16-W高速离心机(湖南湘仪实验室仪器有限公司)；PS-40超声波清洗机(深圳华泰超声设备有限公司)。

盆炎清栓(批号190705、190501、200801、201003、200803、200902，黑龙江天辰药业有限公司；批号200607、200601、191202，亚宝药业四川制药有限公司；批号19110701，瑞阳制药有限公司)。吲哚美辛对照品(批号50826AS，大连美仑生物技术有限公司)，纯度大于99.0%；芦丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、冬青素A对照品均由广州中医药大学赵钟祥教授提供，为前期从冬青属植物及半边旗中分离得到[6-9]，纯度均大于90.0%(其中定量测定者大于98.0%)。甲醇、乙腈(德国默克公司)；甲酸(美国赛默飞世尔科技公司)。

2 方法

2.1 分析条件

2.1.1 色谱 Waters Acauity UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；流动相乙腈(含0.1%甲酸)(A)-水(含0.1%甲酸)(B)，梯度洗脱(定性分析，0～5.0 min，5%～20%A；5.0～18.0 min，20%～45%A；18.0～23.0 min，45%～70%A；23.0～25.0 min，70%～100%A；25.0～28.0 min，100%A。定量测定，0～3.5 min，25%～30%A；3.5～7.0 min，30%～35%A；7.0～9.0 min，35%～50%A；9.0～11.0 min，50%～65%A；11.0～12.0 min，65%～75%A)；体积流量0.4 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。

2.1.2 质谱 ESI离子源；负离子模式(大部分成分在该模式下响应显著优于在正离子模式下，而且在正离子模式下能进行分析的离子在该模式下响应也较好，故选择其进行分析)；气帘气30 psi(1 psi=6.895 kPa)；雾化气、辅助加热气50 psi；离子源温度550 ℃；喷雾电压-4 500 V；去簇电压110 V；碰撞能-45、-25 eV；一、二级扫描范围m/z50～1 350；其他参数均为自动优化值。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液(定性分析) 称取各对照品适量，甲醇制成质量浓度为100～500 ng/mL的溶液，即得，在4 ℃下保存。

2.2.2 对照品溶液(定量测定) 精密称取芦丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、吲哚美辛、冬青素A对照品适量，甲醇分别制成0.2、0.1、0.3、0.1、0.4、0.1、0.5、0.5 mg/mL贮备液，分别精密吸取300、300、125、300、1 050、900、1 600、1 250 μL，置于25 mL量瓶中，甲醇定容，即得(质量浓度分别为2.4、1.2、1.5、1.2、16.8、3.6、32.0、25.0 μg/mL)，在4 ℃下保存。

2.2.3 供试品溶液 精密称取栓剂1.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入45 mL甲醇，称定质量，在常温下超声提取30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，15 000 r/min离心15 min后用于定性分析，稀释10倍后用于定量测定。

3 结果

3.1 化合物鉴定 共鉴定出91个化合物，包括54个三萜、22个苯丙素、9个黄酮、6个其他化合物，并通过相应对照品验证了其中37个的结构，具体见表1，总离子流图见图1。

图1 盆炎清栓负离子模式总离子流图

表1 盆炎清栓中化合物鉴定结果

3.1.1 三萜 该类成分基本上都以齐墩果烷或熊果烷为母核，结合C-3位羰基/羟基、C-4位醛基/羧基/羟甲基、C-17位羧基、C-19位羟基、C-19和C-20位双键；糖基一般是葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸，通常以单糖链或双糖链连接在苷元的C-3、C-23、C-24、C-28位；在ESI源负离子模式下的裂解行为高度相似，基本上都是先逐渐丢失全部糖基，得到苷元准分子离子峰[M-H]-m/z501.32、487.34、485.32、471.34、469.33、455.35，再连续丢失H2O、CO2、HCOOH等，得到系列苷元碎片[5]。

以代表性成分毛冬青皂苷A1(60)、苷元冬青素A(86)为例，见图2。两者加合离子峰[M+HCOO]-分别为m/z709.38、547.33，前者先丢失一分子葡萄糖(m/z162)得到后者(m/z501.32[M-H]-)，再继续发生中性丢失，得到系列碎片离子m/z483.31、457.33、439.32、421.31、395.33、377.32，其中m/z483.31、457.33分别为苷元丢失一分子H2O、CO2所产生，m/z439.32为碎片离子m/z483.31、457.33分别丢失一分子CO2、H2O所产生，m/z421.31、395.33为m/z439.321 7分别丢失一分子H2O、CO2所产生，m/z377.32为m/z421.31、395.33分别丢失一分子CO2、H2O所产生，由此可知苷元中含有2个羧基和2个羟基。冬青属三萜类成分的羧基一般位于C-4、C-17位，羟基一般位于C-3、C-23、C-24、C-19位，故86可能是以齐墩果酸或者熊果酸为母核，结合C-4位羧基、C-19位羟基的化合物，而60的葡萄糖可能是与C-17位羧基形成酯键。通过与对照品比对，60、86分别被鉴定为毛冬青皂苷A1、冬青素A。

图2 毛冬青皂苷A1(60)、冬青素A(86)裂解途径

3.1.2 苯丙素 该类成分主要包括双环氧木脂素、简单苯丙素、咖啡酰基奎尼酸，其裂解方式一般是先发生苷键断裂生成苷元碎片离子，后者再连续丢失H2O、CO2、CH3等产生系列碎片离子。其中，双环氧木脂素、简单苯丙素的质谱鉴定过程见课题组前期研究结果[5]；咖啡酰基奎尼酸在ESI负离子模式下的的裂解方式主要是酰氧键、烷氧键断裂，同时伴有中性丢失H2O、CO2等，如化合物2的碎片离子m/z191.05是母离子发生酰氧键断裂生成的奎尼酸基团，m/z179.04、135.05分别是母离子发生烷氧键断裂生成的咖啡酸基团、咖啡酸基团脱去一分子CO2的产物，与文献[10]比对后鉴定为绿原酸。化合物24的质谱行为与2相似，其特征性碎片离子分别是母离子断裂1、2个酰氧键生成的单咖啡酰基奎尼酸、奎尼酸碎片，与文献[16]比对后鉴定为异绿原酸B。

3.1.3 黄酮 该类成分主要包括芹菜素、山柰酚、槲皮素及其氧苷，在ESI负离子模式下的质谱裂解行为较为相似，大部分是先发生苷键连续的断裂丢失糖基并生成苷元碎片离子，后者再发生中性丢失(CO2、CO、H2O、C2H2O等)，同时C环发生逆狄尔斯-阿尔德(RDA)裂解产生系列碎片离子，将其与相关文献和对照品比对，结果见表1。

3.1.4 其他化合物 包括吲哚美辛、decumbic acid、橄榄苦苷及其同分异构体、硬脂酸、棕榈酸。

3.2 成分含量测定

3.2.1 专属性试验 在预实验中发现，芦丁(20)、冬青苷O(37)、毛冬青皂苷B3(39)、毛冬青皂苷B2(59)、毛冬青皂苷A1(60)、毛冬青皂苷B1(62)、吲哚美辛(76)、冬青素A(86)在“2.1”项条件下母离子响应较好，无明显干扰，符合中药有效成分定量测定要求，故选择其作为指标成分测定含量。取“2.2”项下对照品、供试品溶液，在“2.1”项条件下进样测定，结果见图3，可知各成分分离度、响应较好，在2种溶液中的色谱、质谱行为一致。

20.芦丁 37.冬青苷O 39.毛冬青皂苷B3 59.毛冬青皂苷B2 60.毛冬青皂苷A1 62.毛冬青皂苷B1 76.吲哚美辛 86.冬青素A

3.2.2 线性关系考察 取“2.2.2”项下对照品溶液适量，甲醇稀释成系列质量浓度，在“2.1”项条件下进样测定。以峰面积(Y)对对照品质量浓度(X)进行回归，信噪比(S/N)=10为定量限，结果见表2，可知在各自范围内线性关系良好。

表2 各指标成分线性关系

3.2.3 精密度试验 取“2.2.2”项下对照品溶液适量，在“2.1”项条件下进样测定6次，测得芦丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、吲哚美辛、冬青素A峰面积RSD分别为1.71%、1.18%、1.61%、1.08%、1.75%、0.65%、1.37%、1.86%，表明仪器精密度良好。

3.2.4 重复性试验 取栓剂(190501)适量，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项条件下进样测定，测得芦丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、吲哚美辛、冬青素A峰面积RSD分别为1.41%、2.74%、2.65%、1.18%、0.93%、2.01%、2.89%、0.64%，表明该方法重复性良好。

3.2.5 稳定性试验 取同一份供试品(190501)溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1”项条件下进样测定，测得芦丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、吲哚美辛、冬青素A峰面积RSD分别为1.38%、2.30%、1.53%、0.57%、0.68%、1.71%、1.26%、1.55%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

3.2.6 加样回收率试验 精密称取栓剂(190501)6份，每份0.5 g，加入“2.2.2”项下对照品溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样测定，计算回收率。结果，芦丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、吲哚美辛、冬青素A平均加样回收率分别为101.42%、98.58%、97.84%、101.53%、103.04%、98.77%、101.95%、97.97%，RSD分别为1.53%、2.81%、2.48%、3.39%、2.21%、1.50%、2.74%、1.22%。

3.2.7 样品含量测定 精密称取10批栓剂，每批1.0 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各指标成分含量测定结果

4 讨论

三萜是盆炎清栓中含量最高的一类成分，而且有一部分具有较好的抗炎活性，故测定其含量非常有必要。本实验从盆炎清栓中鉴定了91种成分，包括54个三萜、22个苯丙素、9个黄酮、6个其他类，采用对照品验证了其中37种的结构，总结了三萜类、苯丙素类成分的裂解规律。再建立UPLC-MS法测定芦丁、冬青苷O、毛冬青皂苷B3、毛冬青皂苷B2、毛冬青皂苷A1、毛冬青皂苷B1、吲哚美辛、冬青素A的含量，该方法分析时间短，灵敏度高，可为该制剂质量控制提供简单可行的方法，结果各成分在10批样品中均能被检出，同一厂家不同批次样品中其含量差异较小，表明药材投料一致；除吲哚美辛外，不同厂家样品中部分成分含量差异较大，可能是药材来源不一所致。

本实验考察了不同流动相[甲醇-水、乙腈-水、0.1%甲酸甲醇-水(含0.1%甲酸)、0.1%甲酸乙腈-水(含0.1%甲酸)]、色谱柱[Waters UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、Waters UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)]对盆炎清栓中各成分分离度的影响，发现在Waters UPLC HSS T3柱、0.1%甲酸乙腈-水(含0.1%甲酸)条件下分离度最好，同分异构体37、41、49、54能完全达到基线分离。再比较了甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇超声提取20、30、40、50 min的效果，发现甲醇超声提取30 min时效率最高。