基于分子量探究人参多糖免疫活性构效关系

李珺铭， 刘富饶， 李 波， 吴 巍， 李 慧， 焦丽丽*

(1.长春中医药大学，吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117；2.长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117)

人参PanaxginsengC.A.Meyer是一种名贵药材，人参多糖作为其主要活性成分在人参中占比约为10%。人参多糖是一类无毒、无副作用的天然大分子，因其具有调节免疫、抗肿瘤等多种生物学活性而受备受关注。免疫活性是人参多糖最显著的活性之一[1]。

多糖结构复杂，多糖的分子量[2]、连接键型[2]、支链[3]等都影响其生物学功能。其中，分子量是影响多糖生物学活性的重要因素之一，大量研究表明，分子量对多糖的抗氧化、免疫增强、抗肿瘤等生物学活性都有重要影响[4-6]。基于此，本研究利用乙醇分级及凝胶色谱的方法获得不同分子量的人参多糖，并对其理化性质及体外免疫活性进行比较，以期探究分子量对人参多糖免疫活性的影响，为进一步探究人参多糖免疫活性构效关系奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Infinite M200 PRO酶标仪(瑞士Tecan公司)；Ultimate3000 型液相色谱系统(美国Thermo Fisher Scientific 公司)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；Eppendorf Centrifuge 5810R离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2 试剂与药物D-Glc(批号 110833)、D-GalA(批号 S11020)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、台盼蓝、MTT液、刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)均购自美国Sigma公司；D-Hanks平衡盐、RPMI-1640培养液均购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；牛血清白蛋白购自北京索莱宝科技有限公司。乙腈(色谱纯)购自美国Fisher公司；其余试剂均为分析纯，购自北京化工厂有限责任公司。5年生人参2017年购于通化集安，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定为正品。样品储存于长春中医药大学吉林省人参科学研究院。

2 方法

2.1 人参粗多糖提取 准确称量粉碎后的人参500 g，沸水提取2 h，滤过，残渣重复提取2次，合并3次滤液，80 ℃水浴浓缩。

2.2 人参多糖乙醇醇沉分级 将上述人参提取液加入95%乙醇至乙醇终体积分数为40%，4 ℃静置24 h，离心(8 000 r/min，10 min)，沉淀物加入水复溶后，冻干得到冻干粉称量待用。以此类推，将人参多糖提取液进行60%、80%不同乙醇体积分数醇沉，得到其不同乙醇沉淀级分，分别将其命名为WGP-40、WGP-60、WGP-80。

2.3 人参多糖分级纯化 取0.5 g人参多糖样品溶于10 mL去离子水中，离心(8 000 r/min，5 min)，取上清液上样于Sepharose CL-6B制备柱(3.0 cm×100 cm)，以生理盐水为流动相，苯酚硫酸法跟踪检测洗脱液糖含量，收集相应的多糖级分，透析，冻干，所得粉末即为纯化的多糖样品。

2.4 人参多糖理化性质 采用苯酚硫酸法[7]进行测定糖含量；采用间羟基联苯法[8]进行测定糖醛酸含量；采用Bradford法[9]进行测定蛋白质含量。

2.5 人参多糖的单糖组成测定 单糖组成测定方法为称取2.0 mg样品多糖酸水解，经过苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化，用HPLC检测。采用Ultimate 3000型液相色谱系统，DIKMA Inertsil ODS-3 色谱柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；紫外检测器；体积流量1.0 mL/min；柱温25 ℃；流动相PBS-乙腈(83∶17)；检测波长245 nm[10]。

2.6 人参多糖分子量测定 将样品溶于超纯水，制备成质量浓度为10 mg/mL的糖溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，采用高效凝胶渗透色谱法检测其分子量。色谱条件为TSK-G3000 PWXL色谱柱(7.8 mm×30.0 cm, 5 μm)色谱柱；RID-10A视差折射检测器；体积流量0.5 mL/min；柱温40 ℃；流动相超纯水。利用已知分子量标准葡聚糖(180、2 700、5 250、9 750、13 050、36 800、135 350、300 600 Da)绘制标准曲线用于计算相应样品的分子量[10]。

2.7 免疫活性检测

2.7.1 脾淋巴细胞悬液制备 取正常小鼠并脱颈处死，放于75%乙醇中浸泡后，无菌条件下解剖并取出脾脏，研磨后制备成细胞悬液。用台盼蓝染色法对细胞数进行测定并计算细胞存活率，需保证活细胞数占95%以上，并用培养液将细胞稀释至1×106/mL，制成单细胞悬液[11]。

2.7.2 活性检测 取“2.6.1”项下制备好的脾淋巴细胞悬液加入细胞培养板中，每孔100 μL。加糖样、ConA、LPS，并设置对应的空白对照组，每剂量重复3孔，每孔加培养液补至200 μL，37 ℃、5% CO2培养68 h后，每孔加20 μL MTT，再放入培养箱中继续培养4 h后，吸取上清100 mL，孔中加入150 μL DMSO，用酶标仪在570 nm处测定吸光度(A)值[11]。

3 结果

3.1 人参多糖提取及分级 人参水提液经40%、60%、80%乙醇醇沉后，获得了WGP-40、WGP-60、WGP-80 3个不同的级分，收率分别为11.09%、2.84%、5.41%。利用分子筛凝胶色谱对上述多糖分进一步纯化，其中WGP-40经纯化后得到2个级分WGP-40-F1和WGP-40-F2，见图1，收率分别为49%、37%；而WGP-60和WGP-80进一步纯化后各得到1个级分，分别是WGP-60-F(图2)和WGP-80-F(图3)，收率分别为85.5%、88.8%。

图1 人参多糖WGP-40的Sepharose CL-6B制备层析图

图2 人参多糖WGP-60的Sepharose CL-6B制备层析图

图3 人参多糖WGP-80的Sepharose CL-6B制备层析图

3.2 人参多糖分子量分析 本研究利用高效凝胶渗透色谱法检测多糖级分的分子量，以不同分子量的葡聚糖进行回归，得方程Y=-0.353 5X+9.352 6。根据样品的洗脱时间计算其分子量可知，WGP-40、WGP-60、WGP-80的分子量分布范围分别为1 408～146 042、1 364～140 621、1 357～964 31 Da，表明随着乙醇体积分数的增加，所得的多糖的分子量分布呈现逐渐降低的趋势。对上述3种多糖进行进一步纯化后获得了分子量均一的4个多糖级分，分别是WGP-40-F1、WGP-40-F2、WGP-60-F、WGP-80-F，根据每个级分的洗脱时间可知其分子量分别为131 441、109 177、12 007、3 160 Da(表1)。该结果进一步表明了乙醇体积分数的升高所获的多糖的分子量是降低的。

表1 人参多糖各样品的分子量及理化性质结果

3.3 人参多糖单糖组成 采用PMP衍生及HPLC分析方法测定各人参多糖样品的单糖组成，结果见表2，WGP-40、WGP-40-F1、WGP-40-F2均由Glc组成，为葡聚糖。WGP-60和WGP-80为杂多糖，均是以Glc为主，含量分别为85%、82.86%；同时含有少量的Gal和Ara；WGP-80-F中还有少量的Rha(3.55%)。经Sepharose CL-6B纯化后，所得的分子量均一的多糖级分WGP-60-F和WGP-80-F仍是以Glc为主的杂多糖，但是，纯化后WGP-60-F和WGP-80-F中Ara的含量有所提高。

表2 人参多糖各级分单糖组成的摩尔百分比

3.4 人参多糖免疫活性 采用MTT法对WGP-40-F1、WGP-40-F2、WGP-60-F、WGP-80-F(50、100、200、400 μg/mL)的免疫活性进行了研究，结果见图4～6。当多糖单独作用时，在同等质量浓度作用下，WGP-40-F1对小鼠淋巴细胞增殖的促进作用最强，且呈现剂量依赖关系，并且，4种多糖对淋巴细胞增殖能力的影响由强到弱依次是WGP-40-F1、WGP-40-F2、WGP-60-F、WGP-80-F。同时，WGP-40-F1对ConA诱导的T淋巴细胞和LPS诱导的B淋巴细胞的增殖能力也优于WGP-40-F2、WGP-60-F、WGP-80-F，并且，WGP-60-F和WGP-80-F在低质量浓度时(50、100、200 μg/mL)对淋巴细胞增殖作用不明显，仅在高浓度(400 μg/mL)时能够促进淋巴细胞增殖。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

注：与ConA组比较，*P<0.05，**P<0.01。

注：与LPS组比较，*P<0.05，**P<0.01。

4 讨论

多糖是一类结构非常复杂的生物大分子，多糖的一级结构包括构型、分子量、单糖组成、糖苷键型，分支度、分支位点及支链长度等都影响其生物学活性。其中，植物多糖的分子量是影响其生物活性的重要因素，与多糖的多种生物学活性有密切关系。Su等[12]对4种木耳属多糖的抗氧化研究发现，4种木耳多糖的分子量与体外抗氧化活性成正相关。Li等[13]分别采用对虫草多糖进行提取、分级获得多个多糖级分，在此基础上对其理化性质及抗肿瘤活性进行分析。研究发现，虫草多糖的活性与其分子量密切相关，分子量分布于3 000～10 000 kDa的多糖的抗肿瘤效果最好。Yan等[14]利用乙醇醇沉的方式获得了不同分子量的生大蒜鳞茎多糖，并发现分子量与该多糖的抗氧化、免疫增强作用有密切关系。免疫活性是多糖的一个重要的生物学活性，很多多糖已经在临床上作为增强免疫力的药物而广泛使用，如香菇多糖、褶裂菌多糖、云芝多糖等。多项研究也表明，多糖的分子量是影响其免疫调节活性及抗肿瘤的重要因素。

在本研究中，课题组利用乙醇分级联合分子筛层析获得了分子量不同的4种多糖，研究发现不同分子量的人参多糖在理化性质、初步结构以及体外免疫活性上有显著差别，分子量的大小与所用乙醇体积分数大小呈反比；其中用40%乙醇醇沉后得到的纯化的样品分子量最大，其在收率、糖含量、红外分析以及免疫活性方面都优于其他组分，分子量为131 441 Da的级分(WGP-40-F1)具有较高的免疫增强活性。多糖的生物学活性不仅与其一级结构相关，其高级结构对其活性也有重要的影响，但是由于多糖结构的复杂性，其构效关系研究还很薄弱，对于人参多糖发挥免疫活性的构效关系也需要进行更深入的研究。