超声辅助离子液体提取续断皂苷Ⅵ工艺的优化

胡献跃， 黄东纬， 陈笑笑， 朱兴一

(1.金华职业技术学院，浙江 金华 321016；2.浙江工业大学药学院，浙江 杭州 310014)

续断又名川断、川续断，《神农本草经》列其为治疗骨折、骨质疏松的上品，具有补肝肾、强筋骨、续折损等功效[1]，主要成分包括生物碱、挥发油、皂苷、环烯醚、萜糖苷、多糖等[2]，其中治疗骨质疏松的代表性化合物为续断皂苷Ⅵ。研究表明，续断皂苷Ⅵ可诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，促进成骨细胞分化和矿化[3]，能够增加骨骼密度，改善骨小梁微观结构，有效防治骨质疏松及其继发性疾病[4]。

目前，续断提取工艺以醇提法[5-6]为主，也有水提法[7-9]的报道，但水提物中续断皂苷Ⅵ含量较低(34.9%)[9]，而在水饱和正丁醇中具有较高的溶解度。醇提后常用正丁醇萃取、水溶、石油醚脱脂、沉淀等工序，不仅消耗大量的机溶剂，并且提取过程时间长、次数多，导致能耗高、生产周期长、成本高昂。

离子液体是由阴阳离子组成的室温或接近室温时为液态的物质，与传统有机溶剂和天然产物较单一的相互作用比较，它可与天然产物产生静电、范德华力、氢键等多重相互作用，从而对后者具有较高的溶解度，故被广泛应用于天然产物提取分离中[10]。超声辅助离子液体提取结合了超声产生的高效空化效应和离子液体溶解能力强的特点，是一种高效节能的绿色提取工艺[11]，故本实验采用该方法提取续断皂苷Ⅵ，并对工艺进行优化，以期为该成分工业化生产提供经济环保的工艺路线。

1 材料

1.1 试剂与药物 川续断(产地四川凉州)购于四川盐源县医药有限责任公司，经金华市食品药品检验检测研究院蒋士鹏副主任中药师鉴定为正品。异绿原酸A(DST190918-036，纯度>98.0%)、异绿原酸B(DST191008-037，纯度>98.0%)、异绿原酸C(DST190904-038，纯度>98.0%)、马钱苷酸(DST191025-033，纯度>98.0%)、绿原酸(DST190906，纯度>98.0%)、咖啡酸(DST191030-013, 纯度>98.0%)、马钱苷(DST200628-038，纯度>98.0%)、川续断皂苷乙(DST191202-56，纯度>98.0%)，川续断皂苷Ⅵ(DST191126-041，纯度>99.0%)对照品均由成都德思特生物技术有限公司提供。D101大孔树脂(2019083188)购于安徽三星树脂科技有限公司。1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM]BF4，纯度≥99%)、1-丙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([PMIM]BF4，纯度≥99%)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIM]BF4，纯度≥99%)、1-丁基-3-甲基咪唑溴盐([BMIM]Br，纯度≥99%)离子液体均由中国科学院兰州化学物理研究所提供。

1.2 仪器 Agilent 1260 HPLC色谱仪(美国Agilent公司)；LC2030C plus HPLC色谱仪(日本岛津公司)；旋转蒸发仪(上海耀特仪器设备有限公司)；电子电平(万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；GT-2227QTS超声波清洗器(500 W，广东固特超声股份有限公司)；真空干燥箱(上海精密仪器仪表公司)。

2 方法

2.1 续断皂苷Ⅵ含量测定

2.1.1 色谱条件 填充剂十八烷基硅烷键合硅胶；流动相乙腈-水(含0.15%三氟乙酸)(29∶71)；柱温30 ℃；检测波长215 nm；进样量10 μL。理论塔板数按续断皂苷Ⅵ计，不低于3 000[12]。

2.1.2 方法学考察 取续断皂苷Ⅵ对照品适量，20%甲醇制成1 mg/mL溶液，精密移取1、2、3、4、5 mL至10 mL量瓶中，20%甲醇稀释至刻度，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标(Y)，对照品质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为Y=189 400X-108.36(r=0.999 8)，在0.1～0.5 mg/mL范围内线性关系良好。另外，续断皂苷Ⅵ平均加样回收率为98.6%(RSD=0.9%)，精密度RSD为0.4%。

2.2 离子液体种类筛选 取粉碎后过10目筛的药材10 g，加入离子液体([EMIM]BF4、[PMIM]BF4、[BMIM]BF4、[BMIM]Br)溶液(0.8 mol/L)各100 mL，浸泡2 h后超声(500 W)处理30 min，离心，加水定容至100 mL，取上清液2 mL，加水稀释至100 mL，测定续断皂苷Ⅵ提取率。

2.3 单因素试验

2.3.1 离子液体浓度 配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L离子液体溶液，固定提取功率500 W，料液比1∶10，提取时间30 min，测定续断皂苷Ⅵ提取率。

2.3.2 料液比 固定离子液体种类为[BMIM]BF4，浓度为0.8 mol/L，超声功率为500 W，提取时间为30 min，选择料液比1∶3、1∶5、1∶8、1∶10、1∶15，测定续断皂苷Ⅵ提取率。

2.3.3 提取时间 固定离子液体种类为[BMIM]BF4，浓度为0.8 mol/L，超声功率为500 W，料液比为1∶8，选择提取时间30、45、60、90、120 min，测定续断皂苷Ⅵ提取率。

2.4 响应面法 在单因素试验基础上，通过Design-Expert 11.0.6软件对离子液体浓度(A，0.6、0.8、1.0 mol/L)、料液比(B，1∶6、1∶8、1∶10)、提取时间(C，30、60、90 min)进行3因素3水平响应面分析。

2.5 指纹图谱建立

2.5.1 色谱条件 参考文献[13]报道。Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-水(含0.05%磷酸)(B)，梯度洗脱(0 min,2%A;0～5 min,2%～6%A;5～18 min,6%～10%A;18～40 min,10%～20%A;40～70 min,20%～25%A;70～80 min,25%～35%A;80～90 min, 35%～50%A;90～110 min,50%～60%A;110～120 min,60%～70%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长212 nm；进样量20 μL。

2.5.2 对照品溶液制备 取异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、马钱苷酸、绿原酸、咖啡酸、马钱苷、川续断皂苷乙、续断皂苷Ⅵ对照品适量，20%甲醇制成4 mg/mL溶液，各取1 mL置于20 mL量瓶中，20%甲醇稀释至刻度，即得(质量浓度为0.2 mg/mL)。

2.5.3 水提、醇提液制备 将药材粉碎后过10目筛，准确称取100 g，分别加入10倍量水、70%乙醇，90 ℃回流提取1 h，重复3次，合并提取液，取上清液3 mL，加水稀释至50 mL，即得。

2.6 柱层析分析 将离子液体提取液浓缩，上样大孔树脂柱，分别用水和不同体积分数乙醇洗脱，分段收集洗脱液，测定续断皂苷Ⅵ含量，确定柱层析条件。富集续断皂苷Ⅵ的洗脱液用旋转蒸发仪蒸干后真空干燥，即得离子液体提取物。

3 结果

3.1 离子液体种类筛选 图1显示，离子液体提取物中含有续断皂苷Ⅵ，表明超声辅助离子液体可对该成分进行有效提取。

1.续断皂苷Ⅵ

图2～3显示，离子液体对续断皂苷Ⅵ都有较高的提取率，这是因为它可与该成分进行氢键、范德华力等多重相互作用；以BF4-为阴离子，咪唑阳离子烷基取代链长度从C2增加到C4时，续断皂苷Ⅵ提取率逐渐上升，这是因为随着离子液体烷基链长度增加，它与续断皂苷Ⅵ的范德华力加强，可提高提取率；以[BMIM]+为阳离子时，BF4-对续断皂苷Ⅵ的提取效果优于Br-，这是因为前者极性大于后者，与含多个羟基该成分的相互作用更强。

图2 阳离子种类对续断皂苷Ⅵ提取率的影响

图3 阴离子种类对续断皂苷Ⅵ提取率的影响

3.2 单因素试验

3.2.1 离子液体浓度 图4显示，随着离子液体浓度升高，续断皂苷Ⅵ提取率先迅速上升后缓慢增长，低浓度下更明显，其原因可能为离子液体与该成分的范德华力、氢键作用促进了后者转移，而当其浓度达到一定程度时溶液黏度增加，反而影响了提取效率。综合考虑成本及提取率，选择离子液体浓度为0.8 mol/L。

图4 离子液体浓度对续断皂苷Ⅵ提取率的影响

3.2.2 料液比 图5显示，随着料液比增加，续断皂苷Ⅵ提取率升高，但在1∶8后反而降低，其原因可能为此时该成分基本提取完全，而提取液的增加反而会消耗功率，导致提取量下降。因此，选择料液比为1∶8。

图5 料液比对续断皂苷Ⅵ提取率的影响

3.2.3 提取时间 图6显示，随着提取时间延长，续断皂苷Ⅵ提取率升高，但在60 min后程度不明显。综合考虑提取效率，选择提取时间为60 min。

图6 超声时间对续断皂苷Ⅵ提取率的影响

3.3 响应面法 结果见表1，二次多项回归方程为Y=-424.16+494.29A+36.05B+3.19C+5.5AB-0.65AC-0.029 6BC-249.75A2-2.15B2-0.015 4C2，方差分析见表2。

表1 试验设计与结果

表2 方差分析

最终确定，最优工艺为离子液体浓度0.905 6 mol/L，料液比1∶9.03，提取时间77.8 min，续断皂苷Ⅵ提取率为100.39%。

3.4 指纹图谱建立 以续断皂苷Ⅵ为对照，测定其他成分相对峰面积，结果见表3、图7。由此可知，水提、醇提、离子液体提取对续断皂苷乙、咖啡酸的提取率均很低，并且离子液体提取、醇提对续断皂苷Ⅵ的提取效率明显优于水提。

表3 各成分相对峰面积

注：A～D分别为对照品、醇提物、水提物、离子液体提取物。

3.5 柱层析分析 取离子液体提取液100 mL，旋转蒸发仪浓缩(80 ℃，-0.07 MPa)至30 mL左右，上D101大孔树脂柱，依次用水及10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%乙醇洗脱，洗脱液用量为4倍柱体积，分段收集，每个柱体积收集1瓶，HPLC法测定续断皂苷Ⅵ含量，计算累积回收率，结果见表4。由此可知，水和3个柱体积20%乙醇中不含续断皂苷Ⅵ，但可洗脱离子液体和极性较强的杂质，而2个柱体积60%乙醇基本可将续断皂苷Ⅵ回收完全。

表4 续断皂苷Ⅵ累积回收率测定结果(%)

取水、20%乙醇、60%乙醇洗脱液，在“2.5.1”项色谱条件下进样测定，结果见图8。由此可知，水主要洗脱离子液体和极性成分(如马钱苷酸)，20%乙醇主要洗脱绿原酸、咖啡酸、马钱苷，60%乙醇主要洗脱续断皂苷Ⅵ及异绿原酸A、B、C。

注：A～D分别为对照品、水洗脱液、20%乙醇洗脱液、60%乙醇洗脱液。

3.6 验证试验 根据工艺优化、柱层析分析结果，进行3批验证试验，每批1 000 g药材，结果见表5，可知该工艺稳定可靠，重复性良好。

表5 验证试验结果(n=3)

4 讨论与结论

本实验采用超声辅助1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体提取川续断活性成分续断皂苷Ⅵ，测得提取物收率为12.57%，续断皂苷Ⅵ质量分数79.30%，提取率为99.68%，表明工艺高效可行。离子液体价格昂贵，对其回收利用可大大降低成本，本实验利用大孔树脂进行洗脱，发现续断皂苷Ⅵ主要集中于60%乙醇洗脱液中，不仅实现了离子液体的分离与回收，同时也使提取物得到了纯化。

综上所述，本实验利用离子液体与皂苷的多种相互作用力结合超声辅助提取技术，使川续断皂苷Ⅵ的提取能高效完成，并且未使用正丁醇、石油醚等有机溶剂，减轻了耗能、环保、安全生产压力，同时也解决了提取过程中能源、有机溶剂损耗所带来的成本过高问题，是一种绿色节能的提取工艺。