五味子乙素逆转乳腺癌细胞多柔比星耐药的机制研究

朱文芳 林金辉

乳腺癌是世界上女性癌症死亡的主要原因之一，主要发生于乳腺上皮组织的恶性肿瘤[1]。目前乳腺癌患者除外科手术之外，化疗对各个类型的乳腺癌均有重要的抑制作用[1]。多柔比星（DOX）是临床一线用于乳腺癌治疗的化疗药物，然而，随着化疗周期的延长，乳腺癌细胞通过上调对P-糖蛋白（P-gp）和多药耐药相关蛋白1（MRP1）的表达导致DOX 的耐药性越来越强，同时高累积剂量的DOX 毒副作用增强，会导致化疗失败。因此，寻找提高DOX 化疗敏感性且无毒副作用的药物具有重要的临床意义[2]。研究发现，天然产物能够作为潜在的耐药调节剂，逆转肿瘤耐药继而更好地杀死肿瘤细胞[3]。五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是五味子果实中的一种二苯并环辛二烯类天然产物，已被证明具有多种生物活性，包括抗炎、抗肿瘤及心血管保护等活性[4]。同时研究还发现Sch B 是P-gp和MRP1 的有效抑制剂，能够逆转肿瘤细胞的多药耐药性（MDR）[5]。但Sch B 逆转腺癌DOX 耐药的作用机制尚不清楚，本研究将探讨Sch B 逆转乳腺癌DOX 耐药的可能作用机制，以期为Sch B 临床抗乳腺癌的应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料 Sch B（批号S117968）和DOX（批号A183027）购自上海阿拉丁有限公司。

1.2 细胞系 乳腺癌细胞MCF7 购自美国标准细胞库；乳腺癌细胞MCF7 耐多柔比星MCF7/ARD 由实验室提供。

1.3 主要试剂和仪器 RPMI/1640 培养基、胎牛血清、胰酶均购自美国Gibco 公司；P-gp（批号ab234884）、MRP1（批号ab260038）、磷酸化信号转导和转录激活因子3（p-STAT3，批号ab267373）、信号转导和转录激活因子3（STAT3，批号ab68153）、c-Myc（批号ab32072）、磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，批号ab8245）购自英国Abcam 公司；MTT[（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴化铵）]细胞增殖（批号ST316）、结晶紫染色液（批号C0121）、末端标记法（TUNEL）检测试剂盒（批号C1091）均购自上海碧云天生物技术有限公司。CO2培养箱（BBD6220，美国Thermo 公司）和MK3 型酶标仪（美国Thermo公司）、低温高速离心机（5920R，德国Eppendorf 公司）、化学发光检测仪（LAS4000，美国通用公司）、正置荧光（DM3000，德国徕卡公司）。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 乳腺癌细胞MCF7和MCF7/ARD细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI/1640 培养基中，将细胞培养皿置于37℃、5%CO2培养箱中，培养基每2 天换1 次。

1.4.2 MTT 法检测细胞增殖抑制率 将MCF7和MCF7/ADR 以2×103个细胞/孔的密度接种在96 孔板中，分别加入不同浓度的DOX（1、5、10、20、40、60、80、100μg/mL）以 及 DOX（1、5、10、20、40、60、80、100μg/mL）+Sch B（20μg/mL）继续培养72h，更换含MTT 的新鲜培养基，再孵育4h。加入二甲基亚砜（DMSO），使用酶标仪测量490nm 处的吸光度来评估细胞增殖抑制率，计算IC50和耐药倍数。

1.4.3 集落实验检测细胞增殖水平 将MCF7/ADR接种在6 孔板中，加入DOX（50μg/mL）、Sch B（20μg/mL）以及DOX（50μg/mL）+Sch B（20μg/mL）孵育7 天，4%多聚甲醛固定细胞，再用结晶紫染色15min，在显微镜下拍摄获得图像，计算细胞集落数。

1.4.4 TUNEL 染色检测细胞凋亡 将MCF7/ADR接种在6 孔板中，加入DOX（50μg/mL）、Sch B（20μg/mL）以及DOX（50μg/mL）+Sch B（20μg/mL）孵育24h，4%多聚甲醛4℃固定细胞。PBS 清洗，用0.2%曲拉通X-100（Triton X-100）通透细胞，加入平衡缓冲液室和r-末端脱氧核酸转移酶（rTdT）孵育缓冲液PBS 清洗，二脒基苯基吲哚（DAPI）染核，加适量抗荧光淬灭剂，封片，使用荧光显微镜成像，分析细胞凋亡率。

1.4.5 细胞划痕实验检测细胞愈合情况 将MCF7/ADR 接种在6 孔板中，培养基中孵育直至生长至80%左右，加入DOX（50μg/mL）、Sch B（20μg/mL）以及DOX（50μg/mL）+Sch B（20μg/mL）孵育24h，用无菌移液器枪头在6 孔板内进行细胞划痕，随机视野，分别在0h和24h 通过拍摄来评估细胞迁移率。

1.4.6 Western blot 法检测相关蛋白表达 将MCF7/ADR 接种在6 孔板中，加入DOX（50μg/mL）、Sch B（20μg/mL）以及DOX（50μg/mL）+Sch B（20μg/mL）孵育48h，加入细胞裂解液后收集细胞，测定蛋白浓度。用SDS-PAGE 凝胶分离蛋白质样品，然后转移到PVDF 膜上，用5%牛血清白蛋白封闭膜，加入一抗后在4℃下孵育过夜，然后加入相应的二抗中，于室温孵育2h。对蛋白条带进行曝光，计算蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法 应用SPSS 25.0和GraphPad8.0软件对数据进行分析。本研究数据以均数±标准差（）表示，两者间比较采用t 检验。P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DOX 联合Sch B 用药后耐药细胞株MCF7/ADR 的耐药倍数 MTT 实验结果表明，DOX 对MCF7和MCF7/ADR 的IC50 值分别为（4.01±0.15）、（50.78±0.67）μmol/L，耐药倍数为12.66；DOX 联合Sch B 后 对MCF7 及MCF7/AD 的IC50 值 分 别 为（2.28±0.34）、（13.24±0.58）μmol/L，耐药倍数为5.81，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 Sch B 对MCF7、MCF7/ADR细胞的IC50 及耐药倍数

2.2 DOX 联合Sch B 用药后耐药细胞株MCF7/ADR 的细胞集落数量细胞集落实验表明，相对DOX 组和Sch B 组，DOX+Sch B 组的细胞集落数明显减少，且差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2 各组细胞集落数比较（个，）

表2 各组细胞集落数比较（个，）

注：DOX 组为50μg/mL 的DOX 处理；Sch B 组为20μg/mL 的Sch B处理；DOX+Sch B 组为50μg/mL 的DOX+20μg/mL 的Sch B 处理；DOX 为多柔比星；Sch B 为五味子乙素；与DOX 组相比，aP＜0.01；与Sch B 组相比，bP＜0.01

2.3 DOX 联合Sch B 用药后耐药细胞株MCF7/ADR细胞凋亡率 Tunel 实验检测DOX 组、Sch B组以及DOX+Sch B 组的细胞凋亡水平，三组凋亡率分别为（27.17±2.57）%、（33.67±3.21）%、（74.67±4.51）%，结果显示，与单药组比较，DOX+Sch B 组明显增加MCF7/ADR细胞的凋亡水平，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1、表3。

图1 DOX 联合Sch B 用药后提高耐药细胞株MCF7/ADR的细胞凋亡率

表3 各组细胞凋亡率比较（%，）

表3 各组细胞凋亡率比较（%，）

注：DOX 组为50μg/mL 的DOX 处理；Sch B 组为20μg/mL 的Sch B处理；DOX+Sch B 组为50μg/mL 的DOX+20μg/mL 的Sch B 处理；DOX 为多柔比星；与DOX 组相比，aP＜0.01；与Sch B 组相比，bP＜0.01

2.4 DOX 联合Sch B 用药后耐药细胞株MCF7/ADR 的细胞迁移率细胞划痕实验结果表明，相对DOX 组和Sch B 组，DOX+Sch B 组的细胞迁移率降低，且差异有统计学意义（P＜0.01）。见图2、表4。

表4 各组细胞迁移率比较（%，）

表4 各组细胞迁移率比较（%，）

注：DOX 组为50μg/mL 的DOX 处理；Sch B 组为20μg/mL 的Sch B处理；DOX+Sch B 组为50μg/mL 的DOX+20μg/mL 的Sch B 处理；DOX 为多柔比星；与DOX 组比较，aP＜0.01；与Sch B 组比较，bP＜0.01

图2 DOX 联合Sch B 用药后降低耐药细胞株MCF7/ADR 的细胞迁移

2.5 DOX 联合Sch B 用药后耐药细胞株MCF7/ADR 的P-gp 与MRP1 蛋白表达水平 Western blot结果显示，DOX+Sch B 组的P-gp 与MRP1 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），说明DOX 联合Sch B 后通过降低P-gp 与MRP1 的蛋白水平逆转耐药。见图3、表5。

表5 各组P-gp 与MRP1 的蛋白表达水平比较（）

表5 各组P-gp 与MRP1 的蛋白表达水平比较（）

注：DOX 组为50μg/mL 的DOX 处理；Sch B 组为20μg/mL 的Sch B处理；DOX+Sch B 组为50μg/mL 的DOX+20μg/mL 的Sch B 处理；DOX 为多柔比星；Sch B 为五味子乙素；P-gp 为P-糖蛋白；MRP1为多药耐药相关蛋白1；与DOX 组比较，aP＜0.01；与Sch B 组比较，bP＜0.01

图3 DOX 联合Sch B 用药后下调耐药细胞株MCF7/ADR 的P-gp 与MRP1 蛋白水平

2.6 DOX 联合Sch B 用药后对耐药细胞株MCF7/ADR 的STAT3 通路的影响 Western blot 结果显示，耐药细胞株MCF7/ADR 中的STAT3 通路处于激活状态，而DOX+Sch B 组的p-STAT3和STAT3 信号通路下游c-Myc 的蛋白水平降低（P＜0.01），说明DOX 联合Sch B 后通过抑制STAT3 通路逆转耐药。见图4、表6。

表6 各组p-STAT3和c-Myc 的蛋白表达（）

表6 各组p-STAT3和c-Myc 的蛋白表达（）

注：DOX 组为50μg/mL 的DOX 处理；Sch B 组为20μg/mL 的Sch B处理；DOX+Sch B 组为50μg/mL 的DOX+20μg/mL 的Sch B 处理；DOX 为多柔比星；Sch B 为五味子乙素；p-STAT3 为磷酸化信号转导和转录激活因子3；STAT3 为信号转导和转录激酶因子3；与DOX 组相比，aP＜0.01；与Sch B 组相比，bP＜0.01

图4 DOX 联合Sch B 用药后抑制耐药细胞株MCF7/ADR 的STAT3 通路

3 讨论

乳腺癌是目前影响女性死亡的原因之一，化疗是治疗乳腺癌的主要手段[1]。DOX 是临床上乳腺癌化疗的一线药物，但在治疗过程中容易导致肿瘤细胞产生多药耐药现象，是临床上化疗失败的主要原因[2]。研究发现，P-gp 与MRP1 蛋白是介导DOX 多药耐药的主要蛋白[2]，通过抑制P-gp 与MRP1 蛋白的表达是逆转乳腺癌细胞DOX 耐药的有效措施。

研究发现，活性天然产物单体Sch B 具有逆转P-gp 与MRP1 蛋白介导耐药的能力。李秋萍和盖亚男[6]发现Sch B 具有能够逆转人骨肉瘤细胞U-2OS多药耐药的效果，其机制与下调耐药株的MRP1 基因、蛋白水平以及抑制磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶（PI3K/Akt）通路激活有关。同时研究还发现，Sch B 浓度依赖性地逆转HL60/ADR 耐药，这与化疗药物对MRP1 介导的耐药及增加化疗药物的积聚能力有关[7]。

本研究结果发现，相对于DOX 单药组，Sch B 联合DOX 后能够有效逆转MCF7/ADR 的耐药性，增加耐药细胞MCF7/ADR 对DOX 的敏感性。肿瘤细胞一般具有较强的生存能力和适应力，能够形成集落状态。我们发现Sch B 增强DOX 对MCF7/ADR 的集落形成抑制能力。细胞凋亡是一种常见的程序性细胞死亡方式，化疗药物通过促进细胞凋亡继而起到抗肿瘤作用。相对于DOX 单药组，联合组的细胞凋亡率明显升高，说明Sch B 能够通过提高DOX 对MCF7/ADR 的细胞凋亡从而起到逆转耐药的作用。同时，肿瘤细胞的转移往往是肿瘤治疗失败的主要原因，因此我们对细胞迁移进行相关的研究。实验结果表明Sch B 联合DOX 后降低耐药细胞株MCF7/ADR 的细胞划痕愈合率。

研究表明，STAT3 信号通路与肿瘤细胞化疗耐药性有关，肿瘤细胞能够通过激活STAT3 信号通路来降低化疗药物导致的细胞死亡，继而诱发耐药现象[8]。其中，STAT3 活化介导乳腺癌的侵袭转移。研究表明致癌性细胞因子通过与细胞膜的相应受体结合后导致STAT3 与酪氨酸磷酸化通道相偶联后被激活，从而调节其下游c-Myc 等靶基因表达，参与肿瘤化疗耐药，说明抑制STAT3 通路对逆转肿瘤耐药具有一定的临床意义[9]。进一步的Western blot 的结果表明，Sch B 联合DOX 后能够下调p-STAT3和STAT3 信号通路下游c-Myc 的蛋白水平，说明Sch B 能够通过有效抑制STAT3 通路起到逆转耐药的作用。同时我们也发现耐药细胞株MCF7/ADR 在DOX联合Sch B 联合作用下，P-gp 与MRP1 蛋白表达水平也明显降低。

综上所述，Sch B 可能有效逆转MCF7细胞DOX 耐药，为临床上使用Sch B 等中药逆转乳腺癌耐药提供一定的实验基础，但更需要体内外的进一步研究。