青葙皂苷对过氧化氢诱导的H9c2 心肌细胞凋亡的影响及机制研究

余慧君 彭 晖

青葙皂苷（Celosins，CES）是中药青葙子的主要有效成分，其化合物类别为五环三萜皂苷类，共9类，其中CESⅠ、Ⅱ是其发挥药理作用的主要成分。研究发现，CES 具有抗肿瘤、降血脂、降血糖的作用[1-2]。然而，目前关于CES 对心肌细胞保护作用及机制的研究较少。氧化应激与心肌肥厚、心力衰竭、缺血性心脏病及原发性高血压等的发病机制有关，在这些病理过程中产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）[3]。ROS 过度积累，造成氧化应激。作为活跃的高耗氧量的器官，心脏易受到氧化应激，导致细胞坏死及凋亡[4-5]。抗氧化Nrf2/ARE 信号通路既能平衡细胞内氧化还原状态，还能诱导细胞内的抗氧化酶清除多余的ROS[6]。有报道表明，Nrf2/ARE 信号通路调控细胞氧化应激过程，与动脉粥样硬化形成密切相关，在心血管疾病中发挥重要作用[7-8]。本研究应用H2O2诱导H9c2 心肌细胞损伤模型，探讨CES 对抗心肌细胞氧化应激损伤的作用机制。

1 实验材料

1.1 细胞株 大鼠心肌细胞H9c2（批号RDCL-012）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2 试剂及仪器 噻唑蓝（MTT）（上海源叶生物科技有限公司，批号S19063），高糖培养基（DMEM 培养基）及胎牛血清FBS（美国Gibco 公司，批号12800017、10270106），细胞核蛋白提取试剂盒，RIPA蛋白裂解液，ECL 化学发光试剂盒（碧云天生物技术公司，批号分别为P0027、P0012S、P0015C、P0018FS），ROS 测定试剂盒[翌圣生物科技（上海）有限公司，批号50101ES01]，Western blot 一抗均为兔抗，包括含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3，9 剪切体（cleaved caspase-3，cleaved caspase-9）、血红素氧合酶1（HO-1）、核因子E2 相关因子（Nrf2）、β 肌动蛋白（β-actin）、组蛋白H3（Histone H3）、B 淋巴细胞瘤-2 基因（Bcl-2）（美国abcam 公司，批号分别为ab32539、ab32351、ab32124、ab137550、ab68477、ab5694、ab1791），Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（大连美仑生物技术有限公司，批号MA0220）。流式细胞仪（美国BD 公司，型号CancoⅡ），酶标仪、电泳仪、凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad 公司，型号分别为Cytation1、1658001、GelDoc EZ）。

2 实验方法

2.1 细胞培养 H9c2细胞培养于含10%FBS、1%青霉素与链霉素的DMEM 培养基中，在5%CO2的37℃培养箱中培养。

2.2 MTT 法测细胞活力 H9c2 心肌细胞用0.25%胰酶消化为单细胞悬液，于96 孔板中按4000 个/孔接种，培养24h 后，设置对照组、H2O2处理组、低剂量CES（25μg/mL）+H2O2处理组、中剂量CES（50μg/mL）+H2O2处理组、高剂量CES（100μg/mL）+H2O2处理组，分别加入100μL 培养液，给药组则将CES 用培养基稀释为低、中、高（25、50、100μg/mL）三个剂量加入药物组孔中作用24h 后，H2O2处理组和CES 给药组中均加入300μmol/L H2O2培养4h，按说明书操作并在490nm 波长下测量吸光度。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 将6 孔板中的H9c2细胞分为对照组、H2O2处理组、低剂量CES（25μg/mL）+H2O2处理组、中剂量CES（50μg/mL）+H2O2处理组、高剂量CES（100μg/mL）+H2O2处理组。除了对照组，每组中加入培养基稀释的H2O2，使其最终浓度为300μmol/L 并继续培养4h，利用胰酶将细胞消化为单细胞悬液，离心后加入200μL binding buffer 重悬，按说明书进行Annexin V/PI 染色后，流式仪检测细胞凋亡率。

2.4 检测细胞内活性氧的产生 将细胞按4000 个/孔接种在96 孔培养板，培养24h 后，按2.3 中方式给药处理。培养结束后收集细胞用于ROS 检测。采用ROS 测试剂盒测定细胞内ROS 产生量。取各处理组细胞，加入终浓度为10μM DCFH-DA（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate），在孵箱中孵育30min后，PBS 洗3 次，采用流式细胞仪测定细胞内ROS 的产生量。

2.5 Western blot 检测相关蛋白表达 取2.3 给药处理不同组别的细胞，提取细胞全蛋白；对于核内Nrf 的表达检测，则收集细胞利用细胞核蛋白抽提试剂盒提取蛋白，以上蛋白均经过BCA 蛋白浓度检测试剂盒检测其蛋白浓度，取相同蛋白量制备Western blot 上样样本。分组加入样品槽内进行电泳，电泳结束后转膜并封闭，按1∶1000 进行下列抗体的孵育：caspase -9、caspase -3、bcl -2、Nrf2、HO -1、β -actin、Histone H3。一抗孵育过夜后，进行二抗孵育，待清洗后进行ECL 化学发光处理，利用凝胶成像系统检测。

2.6 统计学方法 应用SPSS 17.0 统计软件对所得数据进行统计分析，计量数据以均数±标准差（）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用t 检验。当P＜0.05 认为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 CES 改善H2O2诱导的H9c2 心肌细胞活力MTT 实验结果表明，与对照组比较，300μmol/L H2O2处理H9c2 心肌细胞后细胞活力明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。而不同浓度的CES 处理的心肌细胞活力明显提升（P 均＜0.05），见表1。

表1 各组H9c2 心肌细胞存活率比较（%，）

表1 各组H9c2 心肌细胞存活率比较（%，）

注：对照组为未经处理的H9c2 心肌细胞；H2O2 处理组为300μmol/L H2O2 处理组；低、中、高剂量CES+H2O2 处理组分别为25、50、100μg/mL CES 同时加300μmol/L H2O2 处理细胞；CES 为青葙皂苷；与对照组比较，aP＜0.05；与H2O2 处理组比较，bP＜0.05

3.2 CES 降低H2O2诱导的H9c2 心肌细胞凋亡率凋亡检测实验发现，与对照组比较，H2O2可显著诱导H9c2 心肌细胞凋亡（P＜0.05）。而CES 的处理能降低H2O2诱导的H9c2细胞凋亡，且效果具有剂量依赖性（P 均＜0.05）。因此，CES 的处理可以改善H2O2引起的H9c2 心肌细胞凋亡，见表2、图1。

表2 各组H9c2 心肌细胞凋亡率比较（%，）

表2 各组H9c2 心肌细胞凋亡率比较（%，）

注：对照组为未经处理的H9c2 心肌细胞；H2O2 处理组为300μmol/L H2O2 处理组；低、中、高剂量CES+H2O2 处理组分别为25、50、100μg/mL CES 同时加300μmol/L H2O2 处理细胞；CES 为青葙皂苷；与对照组比较，aP＜0.05；与H2O2 处理组比较，bP＜0.05

图1 青葙皂苷（CES）有效改善H2O2 诱导的H9c2 心肌细胞凋亡

3.3 CES 对凋亡相关信号通路蛋白表达的影响Western blot 实验显示，与H2O2处理组比较，低、中、高剂量CES 明显降低H2O2处理的H9c2 心肌细胞Bax、cleaved caspase-9 与cleaved caspase-3 蛋白的表达，上调Bcl-2 蛋白的表达，见图2。

图2 青葙皂苷（CES）对凋亡相关蛋白的影响

3.4 CES 预处理可抑制细胞内ROS 的产生 通过检测不同处理组内H2O2诱导的H9c2 心肌细胞ROS产生量，结果发现，H2O2处理后，细胞内ROS 的产生量明显增加（P＜0.05），而经CES 处理组，ROS 含量显著降低，差异有统计学意义（P 均＜0.05），见表3。

表3 各组中ROS 产生水平比较（%，）

表3 各组中ROS 产生水平比较（%，）

注：对照组为未经处理的H9c2 心肌细胞；H2O2 处理组为300μmol/L H2O2 处理组；低、中、高剂量CES+H2O2 处理组分别为25、50、100μg/mL CES 同时加300μmol/L H2O2 处理细胞；ROS 为活性氧；与对照组比较aP＜0.05；与H2O2 处理组比较，bP＜0.05

3.5 CES 调控Nrf2/ARE 信号通路 Western blot 结果显示，H2O2处理组细胞核内Nrf2 的核转位减少，抗氧化酶HO-1 的表达减少；而经CES 处理后，细胞内Nrf2 及HO-1 的表达回调，表明CES 可通过调控Nrf2/ARE 信号通路发挥抗氧化作用，见图3。

图3 青葙皂苷（CES）对细胞内Nrf2/ARE 信号通路的调控

4 讨论

氧化应激是体内氧化和抗氧化作用失衡导致，其中ROS 的过量产生是造成心肌细胞损伤的重要因素之一[9-10]。同时，在冠状动脉粥样硬化性心脏病的缺血和再灌注阶段，都会产生过量的ROS 以维持细胞正常机能与氧化还原状态[11-12]。而H2O2为造成氧化应激的主要成分，可以进入细胞内发生氧化反应，产生大量的ROS，从而造成细胞损伤。

Nrf2 是细胞应对氧化应激的新兴的转录因子之一，其可调控抗氧化反应原件依赖基因的表达，从而调节细胞内因氧化应激所产生的病理结果[13]。在正常条件下，Nrf2 与可kelch 样ech 相关蛋白1（Keap1）结合，而在氧化应激情况下，Keap1 在氧化或烷基化过程中发生构象变化，将Nrf2 与Keep1 分离，Nrf2易位至细胞核，开始与一种称为肌筋膜性纤维肉瘤的转录因子异二聚，由此产生的复合物与抗氧化反应原件ARE 结合并启动下游基因的转录HO-1、QO1 等的表达，产生抗氧化防御系统而发挥心肌细胞的作用[14-15]。本研究发现，CES 可以激活Nrf2，促进其核转移，同时降低HO-1 表达，说明CES 可能通过调控Nrf2/ARE 信号通路抑制H2O2诱导的细胞氧化应激损伤。

氧化应激损伤促进线粒体通透性转换孔（mPTP）开放，促进细胞色素C、caspase-9、caspase-3的活化，引起心肌细胞的凋亡[16-17]。我们研究发现，H2O2处理的可引起H9c2 心肌细胞中凋亡相关蛋白的改变，表明线粒体受损，线粒体凋亡通路被活化。而细胞经不同浓度的CES 预处理后，凋亡相关蛋白的表达水平得到逆转，表明CES 可能通过调控线粒体凋亡通路，对H2O2诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用。本研究发现，H2O2诱导的H9c2 心肌细胞心肌损伤模型中ROS 产生量增加，而CES 处理可降低细胞内ROS 产生量，此结果显示，CES 可能通过减少ROS 的产生而改善心肌细胞凋亡。

综上所述，该研究表明CES 具有抗氧化、抗凋亡作用，并可能通过调控Nrf2/ARE 信号通路从而改善H2O2诱导的H9c2 心肌细胞损伤。