慢加急性肝衰竭合并自发性腹膜炎肠道菌群特征分析

李春青 过建春 荀运浩 王薇薇 石伟珍

自发性细菌性腹膜炎（spontaneous bacterial peritonitis，SBP）可加剧慢加急性肝衰竭并发肝功能损害，明显增加死亡风险，尽早诊断及预防SBP 发生对降低慢加急性肝衰竭病死率有重要意义[1]。越来越多的研究证实肠道菌群与肝脏疾病的发生发展存在密切联系，肠道微生态紊乱对肝衰竭病情进展也有一定影响，但尚待深入研究[2-4]。本研究运用16S rDNA 高通量测序技术对慢加急性肝衰竭患者粪便菌群基因组进行分析，对比有无SBP患者肠道菌群在结构和功能上的异同，旨在探讨慢加急性肝衰竭患者并发SBP 的肠道菌群特征，为提高SBP 诊治能力并最终改善肝衰竭患者预后提供线索。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2017 年6 月—2019 年8 月在杭州市西溪医院住院的慢加急性肝衰竭患者37例，留取大便标本。所有入组患者依据指南及临床经验进行规范化治疗，并随访至24 周。入院诊断为SBP的患者及随访期间发生SBP 的22例患者设为观察组，其余未并发SBP 的15例患者为对照组。本研究经杭州市西溪医院伦理委员会审核通过（审批号：2017 年（科）伦审第04 号）。

1.2 纳入标准（1）符合2015 年《慢性乙型肝炎防治指南》[5]及2012 年《肝衰竭诊疗指南》[6]的诊断标准诊断为慢加急性（亚急性）肝衰竭患者；（2）有慢性乙型肝炎或乙型肝炎肝硬化发病基础；（3）SBP 诊断标准参照2017 年中华医学会肝病学分会制定的《肝硬化腹水及相关并发症的诊疗指南》[7]；（4）自愿参加本研究并签署知情同意书者；（5）年龄16～65 岁。

1.3 排除标准（1）急性肝衰竭、慢性肝衰竭；（2）其他病因（包括自身免疫性、药物性、酒精性、中毒性、寄生虫性）导致的慢加急性（亚急性）肝衰竭；（3）原发性肝癌；（4）抗HIV 阳性，合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒或巨细胞病毒、EB 病毒等其他非嗜肝病毒活动感染；（5）入组时即合并中度脑水肿、严重感染（包括感染性休克、深部真菌感染、2 部位以上感染、二重感染等）、1 型肝肾综合征、消化道大出血等；（6）2 周内使用抗生素或微生态调节剂；（7）胆囊切除或消化道手术史、脾切除史；（8）合并有其他脏器功能严重损伤者及精神病患者；（9）妊娠或哺乳期妇女；（10）不愿合作及依从性差的患者。

2 方法

2.1 标本采集检测及数据分析

2.1.1 标本采集 入组时采集所有受试者新鲜且未被污染的粪便于无菌容器中，置于-80℃冰箱保存；测序前统一提取样本DNA。

2.1.2 16S rDNA 扩增及高通量测序 应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）分别对16S rDNA V4-V5 区扩增，扩增引物根据选定的检测区域确定，利用带有Index 序列的引物，通过高保真PCR 向文库末端引入特异性标签序列。扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测，核酸纯化磁珠法纯化扩增产物，得到原始文库。对已经带有各自Index 标签的样本文库浓度进行适当稀释，后利用Qubit 荧光计对文库进行精确定量，根据不同样本的测序通量要求，按相应比例（摩尔比）混合样本，通过Agilent 2100 生物分析仪检测测序文库插入片段的大小，确认在120～200bp 之间无非特异性扩增，并准确定量测序文库浓度，采用Miseq 测序仪，2×250bp 的双端测序策略对文库进行测序，然后将得到的序列与特定数据库比对，对原始数据进行质控和过滤，使用（practical extraction and report language，Perl）软件对得到的优化序列进行总序列数、总碱基数、序列平均长度统计，再行后续生物信息学分析。

2.2 生物信息学分析 采用R 软件、功能预测软件（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states，PICRUSt）软件对可操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）进行群落组成分析、多样性分析及PICRUSt 功能分析。

2.3 统计学方法 应用SPSS 23.0 统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组均数之间的比较采用t 检验，计数资料采用χ2检验；对分组样本的群落结构以及物种组成进行差异显著性检验，两组样本间COG 功能差异分析采用Welch's t检验，以双侧P＜0.05 为差异有统计学意义；同时对OTUs 等变量进行统计学描述。

3 结果

3.1 两组慢加急性肝衰竭患者一般资料比较 研究共纳入37例慢加急性肝衰竭患者，其中男28例，女9例，年龄20～64（51.28±11.32）岁；对照组22例，男17例，女5例，年龄（49.27±11.31）岁，病程9～26（18.42±2.71）天；观察组15例，男11例，女4例，年龄（54.13±11.06）岁，病程11～30（21.0±3.16）天；两组间一般资料比较，差异均无统计学意义（P 均＜0.05）。

3.2 慢加急性肝衰竭患者肠道菌群群落组成分析丰度Bubble 图显示，在属的水平上观察组患者肠道菌群丰度较高的为拟杆菌属（bacteroides）、大肠杆菌志贺菌属（escherichia/Shigella）、肠球菌属（enterococcus）、副拟杆菌属（parabacteroides）、韦荣氏球菌属（veillonella）、魏斯氏菌属（weissella），而未发生SBP的对照组患者肠道菌群丰度较高的菌属不同，主要有拟杆菌属（bacteroides）、乳杆菌属（lactobacillus）、克雷伯菌属（klebsiella）、普雷沃菌属（prevotella）、链球菌属（streptococcus）、韦荣氏球菌属（veillonella）。观察组拟杆菌属、肠球菌属等丰度高于对照组，而克雷伯氏菌属、乳杆菌属、普雷沃菌属的丰度低于对照组。见图1。

图1 未合并SBP 与合并SBP 慢加急性肝衰竭患者肠道菌群属水平高丰度物种丰度Bubble 图

3.3 慢加急性肝衰竭患者肠道菌群多样性分析

3.3.1 OTUs 的维恩图（Venn）分析 利用Venn 图展示两组患者肠道菌群OTUs 检出情况，观察组和对照组分别含有896和1156 个OTUs，观察组患者可进行肠道菌群后续生物信息学分析的数量低于对照组。见图2。

图2 未合并SBP 与合并SBP 慢加急性肝衰竭患者肠道菌群间共有与特有的OTUs

3.3.2 肠道菌群整体结构分析 基于Bray-Crutis 距离的主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）显示，观察组和对照组之间的分布有一定的距离，表明两组菌群结构差异有统计学意义（P＜0.001），见图3。

图3 未合并SBP（A）与合并SBP（B）慢加急性肝衰竭患者肠道菌群的整体结构分析（基于Bray-Crutis 距离的PCoA 图）

3.4 PICRUSt 功能分析 以PICRUSt 预测肠道菌群功能，发现两组之间共有8 条差异通路：细胞壁/膜/包膜生物发生、碳水化合物转运和代谢、无机离子转运与代谢、氨基酸转运与代谢、RNA 加工与修饰、翻译后修饰、蛋白质转换和伴侣蛋白等（P 均＜0.05），见图4。

图4 未合并SBP（A）与合并SBP（B）慢加急性肝衰竭患者肠道菌群COG 功能组间差异分析

4 讨论

肠道菌群紊乱是指肠道菌群在结构、数量、整体功能等方面发生改变，原有的动态平衡被打破；SBP的发生与机体免疫力下降、肠道黏膜屏障受损以及肠道细菌过度生长和易位相关，已知肠道菌群紊乱是SBP 重要的发病机制之一[8]。肠道与肝脏之间通过门脉系统联系，肝脏大约70%的血液供应来自肠道，慢加急性肝衰竭患者发生SBP 与其肠道菌群的变化有着密切的关系[9]。肠道免疫系统通过肠-肝轴影响免疫介导的肝损伤，肠道微生态失衡与肝衰竭发病机制有关，微生物群落组成的变化与肝病严重程度相关[10]。慢加急性肝衰竭为肠道细菌过度生长创造了条件，肠道细菌易位的发生率明显增高，研究显示，细菌易位常发生于临床SBP 出现之前[11-12]。本研究中，腹膜炎组与未发生腹膜炎组患者肠道菌群中多个高丰度菌属的差异提示肠道菌群易位可能参与了慢加急性肝衰竭患者并发SBP 的过程。

革兰氏阴性肠杆菌是失代偿期肝硬化患者最常见的易位细菌之一，肠杆菌在肠道内过度生长和产毒素作用破坏肠道黏膜的屏障作用，导致机体发生菌血症和毒血症，而肠腔中大肠埃希菌更容易穿透肠系膜淋巴结[13-14]。有研究对SBP 分布特点分析发现，SBP患者腹腔积液培养分离的病原菌中首位为大肠埃希氏菌[15]。本研究结果显示，在合并SBP患者中肠道菌群大肠杆菌志贺菌属丰度明显高于未发生SBP 组，进一步证实慢加急性肝衰竭患者临床上并发SBP 与特定微生物过度生长并向肠外播散有关[16]。乳酸菌是肠道微生物中重要的有益菌之一，动物实验显示乳酸杆菌通过激活肠道固有淋巴细胞产生白细胞介素（IL）-22 增强肠黏膜屏障功能，还可通过抑制致病菌调节菌群紊乱[17]。本研究发现，未发生腹膜炎组患者肠道菌群中乳酸菌属有着较高的菌群丰度，认为乳酸菌可通过上述功能，减少患者腹膜炎的发生。

慢加急性肝衰竭并发腹膜炎患者不仅肠道有益菌菌群丰度明显降低，菌群数量也明显减少[18]，本研究中腹膜炎组和无腹膜炎组分别含有896和1156个OTUs，无腹膜炎患者肠道菌群物种数量多于腹膜炎组，推测肠道菌群丰度的降低可能影响肝衰竭患者并发SBP 的风险。慢加急性肝衰竭患者并发SBP不仅与肠道菌群丰度、数量的改变有关，可能与肠道菌群整体结构的改变也有关系，本研究中PCoA 分析结果显示，并发SBP 与未发生SBP患者肠道菌群结构差异有统计学意义（P＜0.001）。一项评估利福昔明临床疗效的研究发现，肝硬化腹水消退后患者肠道菌群结构与治疗前有明显的差异，可能通过影响肠道菌群整体结构来治疗SBP[19]。

肠道微生物的多个功能通路参与了机体糖、氨基酸和外源物质等的代谢，肝脏疾病会影响肠道菌群结构，而肠道菌群的变化对肝脏葡萄糖和脂质代谢等也有着一定作用[2，20]。目前对慢加急性肝衰竭并发SBP 肠道菌群功能通路的研究较少，本研究中通过筛选差异性代谢物并进行COG 功能差异分析，结果显示慢加急性肝衰竭患者有无并发腹膜炎两组间在多个转运代谢途径存在明显差异，主要集中在氨基酸、碳水化合物、无机离子等转运代谢途径，据此推测肠道菌群结构的变化可能引起机体代谢异常，慢加急性肝衰竭并发SBP 可能与上述代谢途径及通路的异常有关，肠道菌群通过多个代谢途径影响机体的代谢，是调节肝脏疾病的重要参与者。本研究仅应用16S rDNA 进行了初步的功能预测，每种代谢内部基因调控的变化后续需行宏基因组进行功能分析。

肠道菌群易位可能参与了SBP 的一系列疾病变化过程，加速病情进展，因此研究其早期发病机制，可以延缓甚至阻止肝病的进展及SBP 发生[21]。通过调节肠道菌群紊乱可改善肠道微生态环境，减少肠道屏障损伤，进而改善肝脏功能[22]。机体肠道微生物的组成结构复杂，肠道菌群与终末期肝病自发性细菌性腹膜炎之间的因果关系还需要进一步研究。可以扩大样本量进行纵向深入的研究，建立肠道微生物与血清代谢物相结合的预测模型，用于终末期肝病SBP 的临床诊断，提高SBP 的早期诊断率，从而降低死亡率。