自噬相关基因Beclin1、LC3在妊娠期糖尿病患者胎盘组织表达及临床意义

王洪伟，关红琼，王茹，黄晓妹

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是常见的妊娠期并发症，随着人们饮食、生活习惯的改变，GDM发病率有上升的趋势[1]。GDM不仅增加了孕妇发生不良妊娠结局的风险，同时也增加了孕妇妊娠后2型糖尿病和心血管疾病的发病风险[2]。因此，研究与GDM发生有关机制具有重要的意义。自噬广泛存在于各种生物细胞中，是细胞内物质代谢的重要途径，参与细胞生长分化、废物清除及结构重建等多种生理过程。自噬失调与多种疾病的发生发展有关，研究表明，高糖水平可增强绒毛外滋养细胞的自噬[3]。Beclin1、微管相关蛋白轻链3(microtubule associated protein light chain3，LC3)是编码自噬相关蛋白的重要基因[4-5]，现检测GDM患者胎盘组织Beclin1、LC3表达水平，并分析二者与GDM患者一般资料之间的关系，探讨自噬在GDM发病机制中的可能作用，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年4月—2021年2月在海南医学院第二附属医院产科行剖宫产的GDM患者95例为研究对象(GDM组)，年龄23～37(29.84±3.58)岁，孕周36～40(38.17±1.83)周。同期选取在医院行剖宫产的正常妊娠孕妇95例为对照组，年龄21～38(29.27±4.31)岁，孕周36～41(38.62±2.01)周。2组孕妇均为单胎妊娠，年龄及孕周比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准(批号：[2019]伦审核第13号)，受试者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 GDM患者参照“妊娠合并糖尿病诊治指南(2014)”[6]中关于GDM诊断标准确诊。(1)纳入标准：①孕前无糖尿病，妊娠期为首次诊断；②既往无不良妊娠史；③临床资料完整。(2)排除标准：①合并肾病等其他妊娠期并发症；②患有自身免疫性疾病；③合并甲状腺、垂体等内分泌疾病。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 临床资料收集：收集2组孕妇体质量指数(BMI)、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)水平，以及分娩时新生儿体质量等资料。

1.3.2 胎盘样本处理：孕妇分娩后30 min内获取胎盘组织，称取胎盘质量。取胎盘母体面中央组织2 cm×2 cm×2 cm组织块，生理盐水漂洗，留取一部分保存至-80 ℃冰箱，其余用4%多聚甲醛固定12 h，梯度酒精脱水30 min，石蜡包埋。

1.3.3 胎盘组织中Beclin1、LC3 mRNA表达检测：采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测，以RNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司)对胎盘组织中RNA进行提取，检测RNA浓度，将提取的RNA反转录为cDNA，之后进行qRT-PCR反应，反应条件：预变性 95℃ 5 min，变性 95 ℃ 30 s，退火 60℃ 30 s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法计算Beclin1、LC3 mRNA的相对表达量。

表1 胎盘组织中Beclin1、LC3 mRNA引物序列

1.3.4 胎盘组织中Beclin1、LC3蛋白表达检测：采用免疫组织化学法检测，石蜡标本进行连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱蜡至水，PBS清洗，抗原修复，室温封闭1 h。加入兔抗人Beclin1、LC3单抗(英国Abcam公司)，4 ℃孵育过夜，加入山羊抗人IgG二抗(英国Abcam公司)(稀释比1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，加入DAB染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)进行染色，苏木素复染，酸酒精短暂分化后，脱水、透明、封片。细胞质或细胞核内出现黄色或棕色颗粒为阳性。采用免疫反应积分(IRS)法对染色结果进行半定量评分。阳性细胞百分比评分：无阳性细胞 0分，占比<25%记1分，25%≤占比≤50%记2分，50%<占比≤75%记3分，占比>75%记4分。阳性细胞染色强度评分：无染色0分，浅黄色1分，黄褐色2分，棕褐色3分。IRS=阳性细胞百分比评分×阳性细胞染色强度评分，以IRS≤3分为阴性，IRS>3分为阳性。

1.3.5 妊娠结局：记录孕妇和胎儿健康状况，如发生产后出血、羊水过多、胎儿窘迫、巨大儿等为不良妊娠结局。

2 结 果

2.1 2组临床资料和不良妊娠结局比较 与对照组比较，GDM组年龄、孕周差异无统计学意义(P>0.05)，BMI、FPG、FINS、胎盘质量、新生儿体质量及产后出血、羊水过多、胎儿窘迫、巨大儿发生率均显著升高(P<0.05),见表2。

表2 GDM组与对照组临床资料和不良妊娠结局比较

2.2 2组胎盘组织Beclin1、LC3 mRNA表达水平比较 与对照组比较，GDM组胎盘组织Beclin1、LC3 mRNA表达水平均显著升高(P<0.01)，见表3。

表3 GDM组与对照组胎盘组织Beclin1、LC3 mRNA表达水平比较

2.3 2组胎盘组织Beclin1、LC3蛋白表达比较 Beclin1、LC3均在细胞膜和细胞质中表达。与对照组比较，GDM组胎盘组织Beclin1、LC3蛋白阳性表达率均显著升高(P<0.01)，见表4、图1。

图1 对照组与GDM组胎盘组织Beclin1、LC3蛋白表达比较(免疫组织化学染色，×200)

表4 GDM组与对照组胎盘组织中Beclin1、LC3蛋白表达比较 [例(%)]

2.4 胎盘组织Beclin1、LC3蛋白表达在GDM患者不同临床资料和不良妊娠结局中比较 Beclin1及LC3蛋白表达在GDM患者年龄、孕周、BMI比较差异无统计学意义(P>0.05)；Beclin1及LC3蛋白阳性表达GDM患者FPG、FINS、胎盘质量、新生儿体质量及产后出血、羊水过多、胎儿窘迫、巨大儿发生率均高于Beclin1、LC3蛋白阴性表达GDM患者(P<0.05)，见表5。

表5 胎盘组织Beclin1、LC3蛋白表达在GDM患者不同临床资料和不良妊娠结局中比较

2.5 Logistic回归分析影响GDM患者发生不良妊娠结局的危险因素 以GDM患者是否发生不良妊娠结局为因变量，排除年龄等混杂因素后，以胎盘组织Beclin1、LC3蛋白表达为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果表明,胎盘组织Beclin1、LC3蛋白阳性表达是GDM患者发生不良妊娠结局的危险因素(P<0.01)，见表6。

表6 Logistic回归分析影响GDM患者发生不良妊娠结局的危险因素

3 讨 论

GDM是指孕妇妊娠期间首次发生或出现糖尿病，影响GDM发生的危险因素包括超重、肥胖、高龄、家族糖尿病史等[7]。正常妊娠过程中，母体会通过一系列的生理变化以满足胎儿生长的需要，胰岛素敏感性降低是重要的代谢适应，在妊娠后期，孕妇处于胰岛素抵抗状态，使血糖稍微升高，促进葡萄糖通过胎盘运输，促进胎儿的生长[8]。目前主要认为胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍导致的糖耐量受损是引起GDM发生的主要原因[9-10]。本研究结果表明，GDM患者FPG、FINS均显著高于正常妊娠孕妇。胎盘是母体与胎儿物质交换的主要器官，GDM可导致胎盘细胞功能、血管发生异常，导致胎盘发生病理性变化，从而影响子宫内胎儿的正常生长发育[11]。本研究结果表明，GDM患者胎盘质量、新生儿体质量及产后出血、羊水过多、胎儿窘迫、巨大儿发生率均显著高于正常妊娠孕妇，提示GDM发生过程中胎盘形成异常，可能会导致不良妊娠结局的发生，具体机制有待深入研究。

自噬是在缺氧、内质网应激、氧化还原应激等状态下，维持细胞内能量稳态的过程，自噬失调与包括糖尿病在内的代谢性疾病的发生发展有关[12]。Akcora等[13]研究表明，与正常妊娠孕妇比较，子痫前期孕妇自噬活性增加。Tu等[14]研究表明，抑制自噬能够减轻糖尿病肾病大鼠的胰岛素抵抗。Beclin1、LC3蛋白均是自噬的标志性蛋白，Beclin1基因位于人染色体17q21，其编码的Beclin1蛋白是自噬发生与调控的主要蛋白之一，其通过调节自噬前体的形成，引导相关蛋白定位于自噬体膜，其还可以调节细胞自噬与凋亡之间的平衡[15-16]。LC3定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，与自噬体的形成有关，是表示自噬程度的特异性蛋白[17]。本研究发现，GDM组胎盘组织中自噬基因Beclin1、LC3 mRNA表达水平及蛋白阳性表达率显著高于对照组，且Beclin1、LC3蛋白阳性表达GDM患者FPG、FINS水平高于阴性表达患者，提示自噬可能与GDM的发生有关，与Li等[18]研究结果相似，猜测是因为高血糖抑制胎盘血管生成，导致GDM患者胎盘组织缺血、缺氧，细胞中活性氧水平增加，激活自噬。正常自噬能够维持细胞功能和组织结构，而过度自噬会引起内皮细胞损伤，引起胎盘发育异常，导致组织缺血、缺氧、营养缺乏，引发胎盘功能障碍，增加巨大儿等不良妊娠结局发生的风险[19]。Li等[18]研究表明,GDM患者胎盘中白介素-6(IL-6)、IL-8等炎性因子及自噬相关基因7(ATG7)和Beclin1表达显著升高，胎盘中炎性反应和自噬的发生会增加新生儿感染的风险。进一步分析发现，GDM组胎盘组织中Beclin1、LC3蛋白阳性表达患者胎盘质量、新生儿体质量及不良妊娠结局的发生率均高于Beclin1、LC3蛋白阴性表达患者，提示自噬可能与胎盘异常生长及不良妊娠结局有关。Logistic回归分析结果表明，胎盘组织Beclin1、LC3蛋白阳性表达是GDM患者发生不良妊娠结局的危险因素，原因可能是高糖水平可能引发胎盘的自噬，导致不良妊娠结局的发生，具体机制有待进一步的研究。

综上所述，GDM患者胎盘组织中自噬基因Beclin1、LC3表达显著升高，胎盘组织中Beclin1、LC3蛋白阳性表达是GDM患者发生不良妊娠结局的危险因素，自噬可能与GDM的发生及不良妊娠结局有关。由于本研究仅从临床水平上分析了胎盘组织中Beclin1、LC3的表达情况，下一步还需结合体外实验进一步探讨自噬在GDM发生发展中的可能机制。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

王洪伟：设计研究方案，课题设计，实施研究过程，论文撰写；关红琼：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；王茹：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；黄晓妹：进行统计学分析