补体系统在子宫内膜异位症发生机制中的研究进展

于洋洋综述 张宗峰审校

子宫内膜异位症(endometriosis, EMs)是一种慢性炎性疾病，由于缺乏明确的检查手段和生物标志物，目前诊断仅依靠腹腔镜探查等有创操作，因此常常延误诊断[1-2]。补体系统在EMs中经常发生改变，且与疾病的早期阶段相关[3]。补体系统是参与腹膜中异位内膜清除与炎性反应最重要的免疫机制之一[4]。现总结EMs中补体系统的研究进展，为补体系统作为EMs的潜在治疗靶点提供新思路。

1 EMs概述

EMs是一种常见的妇科雌激素依赖性疾病，其特点为子宫内膜组织在子宫体外的部位生长、浸润、种植而产生痛经、不孕、性交痛等临床症状[1]，累及10%～15%的育龄妇女和高达60%的不孕妇女。虽然EMs的发病机制尚不清楚，有很多关于EMs发病机制的学说，传统学说包括“经血逆行学说”“体腔上皮化生学说”“淋巴和静脉播散学说”等，其中Sampson在20世纪20年代提出的经血逆行学说是EMs发生发展过程中最为人接受的学说。现在认为月经期子宫内膜逆流是一个普遍现象，但由异位内膜种植引起的EMs仅占10%～15%，可见该理论无法完全解释EMs的起源及进展。有研究表明，月经过程中脱落的子宫内膜逆行转移到异位部位很大程度是由于免疫功能障碍、腹膜环境改变、逆行运输的子宫内膜清除减少[2, 5]。随着大批学者不断进行基础和临床的深入研究，近年来国内学者提出“在位内膜决定论”，并发现EMs发生与干细胞、血管形成、内分泌及免疫等因素密切相关，对于上述传统学说进行了重大补充及发展。EMs病变广泛、形态多样, 虽为良性病变，但具有侵袭和复发的特点, 被视为“良性癌”，如今更多称之为“慢性病”或“可管理的疾病”。其治疗方法从根治性的手术逐渐转变到“缓解疼痛, 改善生育, 综合治疗, 长期管理”的治疗理念。20%的EMs患者手术后在2年内复发, 5年复发率为40%～50%，术后治疗的选择非常重要，需要长期管理以提高患者的生活质量，解决不同年龄阶段最主要的临床问题是临床治疗的终极目标[6]。

2 补体系统

补体系统是一种由50多种可溶性蛋白和膜结合蛋白组成，包括补体固有成分(如 C1～C9)、补体受体(如 CR1、C3bR)和补体调节蛋白(如 CFB、CFH)，具有多种调控机制的蛋白质反应系统，一般存在于血清、组织液和细胞膜表面。体内许多不同组织细胞均可合成补体蛋白，包括肝细胞、角质形成细胞等，特别在炎性反应部位中，补体主要由巨噬细胞产生，不同补体成分的主要合成部位各不相同[7]。补体蛋白(如C1qrs、甘露糖结合凝集素、P因子)通过结合特定分子如抗原—抗体复合物、病原体表面甘露糖残基、病原体表面多糖，从而启动补体蛋白水解级联反应。经典途径、凝集素(mannose-binding lectin,MBL)途径和旁路途径是补体系统3种主要激活途径[8]，均具有共同的终末途径。补体激活途径可分为4个主要步骤，即补体激活、C3 转化酶形成、C5 转化酶生成和膜攻击复合物(membrane attack complex，MAC)组装[9]。其中涉及到蛋白质裂解成激活的C3a和C5a亚单位，这2个亚单位在促炎反应和免疫细胞的招募中起着重要作用。C3b裂解产物可以附着在病原体上，通过免疫细胞上的C3b受体标记它们的吸收和降解(吞噬作用)。病原体的清除也可以由C5b片段介导，C5b片段形成MAC的一部分，插入靶细胞膜，导致孔隙形成和溶解[9-11]。此外，膜结合性补体调节蛋白及可溶性补体调节蛋白通过对补体级联酶促反应过程中酶活性及MAC组装等关键步骤进行精密调控，以调节特定免疫效应及反应强度，使宿主细胞免遭补体系统的破坏。补体系统除了MAC产生的细胞毒作用，还能诱导免疫反应的其他作用，包括调理作用、炎性介质作用、免疫黏附等作用。补体系统是先天性免疫的组成部分，将先天性免疫与适应性免疫紧密联系在一起，通过其调理作用参与特异性体液免疫应答；同时补体系统与机体内凝血系统、激肽系统和纤溶系统存在密切联系：(1)4个系统均通过丝氨酸蛋白酶结构域发挥作用；(2)一个系统的活化可对另一系统产生影响。补体系统通过与这些系统相互作用，与TNF-α、IL-6等细胞因子相互协同或制约，形成复杂的炎性介质网络，扩大并加重炎性反应，参与多种炎性反应性疾病[11-12]。目前某些研究表明，补体系统在EMs病理生理中有重要作用。然而，此类研究数量较少，具体意见存在分歧[10, 12]。

3 补体系统各成分与EMs发生的关系

3.1 C1 Sikora等[13]用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定了早期[美国生殖医学会(r-ASRM) Ⅰ、Ⅱ期]EMs患者35例、晚期(Ⅲ、Ⅳ期)EMs患者25例、非EMs患者20例腹腔液中C1q和C1INH浓度，发现EMs患者腹腔液中C1q和C1INH水平明显高于非EMs患者，早期EMs患者高于晚期EMs患者。此外计算了 C1q 和 C1INH的浓度比，与对照组相比，EMs组腹腔液中 C1q/C1INH 比值显著升高，且早期EMs高于晚期EMs。C1q是启动补体系统经典激活途径的第一个因素。现有研究证明，C1q可以在其他疾病中发挥重要作用，包括自身免疫性疾病。需要免疫复合物的抗体IgM、IgG来启动C1复合物的激活。最近，研究报道了EMs患者表现出B细胞活化和全身抗体产生增加。免疫球蛋白和异位子宫内膜细胞的复合物可能在EMs中激活补体经典途径起作用，尤其是在疾病的早期阶段。考虑到 C1INH 是抑制补体经典激活途径必需的起始方式，EMs中发现了较高浓度的C1INH表明可能存在抑制补体激活和影响C1INH分泌的附加因素。据报道[4]，C1S、C1QA、从GEO数据库收集的3个微阵列数据集利用GO分析、Hallmark途径富集分析、蛋白质—蛋白质相互作用(PPI)网络分析和基因共表达相关分析等一系列生物信息学技术对Hub基因进行鉴定，用RT-PCR和Western-blot验证了EMs组C1S、C1QA、C1R在mRNA和蛋白水平较非EMs组表达上调，同时补体C1S、C1QA、C1R与组织因子(tissue factor, TF)呈正相关。众所周知，TF可与凝血Ⅶ-a因子结合，参与外源性凝血途径，因此猜测TF可能是EMS中补体与凝血之间的桥梁纽带，表明补体C1S、C1QA、C1R具有较好的凝血途径相关性和EMs相关性。有2种机制可以解释这种关联：(1)MAC锚定在细胞表面时，MAC可以刺激蛋白二硫键异构酶的氧化来上调TF活性；(2)MAC可通过结合在内皮细胞或血小板表面诱导膜翻转暴露磷脂酰丝氨酸促进凝血酶原复合物[因子Ⅴa/因子Ⅹa/凝血酶原(Ⅱ)]和凝血酶(Ⅱa)的生成来增强血小板促凝血反应。另外激活的血小板还可以被招募到病变部位，并产生TGF- β以促进EMs的发展[14]。

3.2 C3 补体C3是目前研究最多的补体蛋白。以往研究表明，C3存在于大多数EMs患者的子宫内膜中[15]。其他研究在此基础上更进一步，发现EMs患者的血清C3水平显著高于非EMs患者[4, 16]。不仅在异位生长的子宫内膜中可以检测到异常的C3水平，EMs在位内膜的代谢同样也受到异位内膜的影响，有研究比较12例经腹腔镜检查证实EMs患者在位和异位内膜组织中C3基因的表达，发现C3 mRNA水平及蛋白水平在异位腺体中的表达明显高于在位腺体[17]。有研究采用放射免疫分析法发现正常子宫内膜中以月经周期依赖的方式产生C3，分泌期大于增殖期，子宫内膜基质细胞分泌补体C3的能力明显高于相应的上皮细胞[12]。另有研究采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法比较EMs组82例与非EMs组30例腹腔液和血清中iC3b、C3c水平，发现EMs组腹腔液和血清C3c水平均高于非EMs组，而iC3b则有相反的趋势。研究还发现，EMs组血清C3c水平高于腹腔液，血清iC3b水平低于腹腔液。血清和腹腔液中iC3b水平比较，早期(r-ASRMⅠ～Ⅱ期)EMs患者的浓度均高于晚期(r-ASRM Ⅲ～Ⅳ期)EMs患者[18]。iC3b和C3c均是补体C3在因子Ⅰ的蛋白水解影响下产生的衍生物，已有文献表明，C3b和iC3b均具有胚胎营养作用，所以EMs患者腹腔液中发现iC3b降低可能导致不育。一项研究用C3基因敲除小鼠和野生型小鼠构建EMs模型，3周后解剖发现野生型EMs小鼠产生的腹膜异位囊肿数量更多，且分离的腹膜冲洗液呈现更多脱颗粒肥大细胞。将正常子宫内膜细胞与肥大细胞共培养，发现使用EMs的腹腔液刺激肥大细胞引起正常子宫内膜细胞C3 mRNA表达水平增多，EMs的腹腔液与阻断性单克隆抗C3a抗体预孵育完全消除了EMs的腹腔液刺激影响，使C3水平达到静息值，另外发现TNF-α刺激共培养细胞与EMs的腹腔液刺激共培养细胞产生C3水平相当，从而猜测C3a参与MCs和EM细胞之间的炎性反应存在自动放大环[15]。由EMs演变而来的卵巢透明细胞癌 (ovarian clear cell carcinoma, OCCC)早期(FIGO分期Ⅰ和Ⅱ期)和晚期(FIGO分期Ⅲ和Ⅳ期)的免疫发病机制中，基于从GEO数据库下载的5 917个基因中选择差异基因进行GO分析发现，补体旁路途径可能是OCCC各期致癌的最主要的二元性免疫紊乱途径，且在促进和抑制OCCC进展方面发挥双重作用；并发现7个与补体系统相关的差异基因CFP、VSIG4、C9、C8B、C7、C3和C5，免疫组织化学分析显示，OCCC患者C3a、C5a表达水平高于对照组，进而推测补体系统可通过PI3K/AKT途径激活C3aR和C5aR促进肿瘤生长，敲除或沉默PI3K或AKT基因减少肿瘤细胞增殖、生长，从而消除C3aR和C5aR刺激的影响[19-20]。Anastasiu等[21]提出C3可作为EMs的潜在生物标志物，原因是采用二维凝胶分析方法及质谱法筛选出EMs患者的血清白蛋白和补体C3前体的蛋白表达水平显著高于对照组，采用ELISA法比较EMs组及对照组血清中锌-α2-糖蛋白表达，差异具有统计学意义，ROC曲线分析发现特异度为100%、敏感度为69.4%，可作为EMs一种新的无创诊断检测方法。上述研究表明，EMs中异位子宫内膜组织分泌C3高于在位内膜组织，且EMs患者的C3基因表达高于无EMs患者，因此C3及其裂解组分可能是EMs的潜在生物标志物和可能的靶向药物靶点。

3.3 C4 C4和EMs之间的关系存在争议。研究表明，EMs患者血清和腹腔液中的C4水平高于无EMs患者，还发现晚期EMs患者体内C4水平高于早期EMs患者[18]。另有研究采用NanoString技术检测分泌期EMs组的异位内膜组织、在位内膜组织与分泌期对照组基因差异表达，表明EMs组异位子宫内膜组织、在位内膜组织C4A/B的基因表达水平高于对照组[22]。此外有研究发现，在EMs患者和非EMs患者中没有发现血清C4水平存在统计学差异[23]。亦有报道发现，卵泡期EMs组血清C4水平低于卵泡期对照组[24]。通过二维凝胶电泳评估腹膜EMs、卵巢EMs 和非EMs妇女腹腔液中C4a的表达水平，结果显示，腹膜EMs和卵巢EMs妇女C4a表达下调[25]。结合以上文献，C4及其裂解组分与EMs关系暂不明确，有文献表明，EMs中补体系统变化与月经周期、EMs分期等因素有关，上述研究纳入对象较少、对照组差异较大、研究方法不同、EMs分期及月经周期分期未清楚区分，有待进一步研究C4及其裂解组分与EMs关系。

3.4 C5 C5作为一种补体蛋白在炎性反应和细胞杀伤中起到了不可或缺的作用，这有赖于其他补体蛋白，例如C3、C4等裂解产物组合而成的C5转化酶。这种蛋白酶将C5降解为C5a和C5b。C5a游离于液相，是重要的炎性介质，能够刺激腹膜肥大细胞和巨噬细胞产生组胺或细胞因子等介质，进而增加子宫内膜血管通透性，导致炎性反应和疼痛。C5b可与C6稳定结合随之形成MAC。Aslan等[26]研究采用RT-PCR方法将EMs患者中异位子宫内膜组织和在位子宫内膜组织相比较，发现C5基因上调最为显著达173倍。另外，Ahn等[22]研究发现也验证了C5基因在EMs组异位内膜组织表达高于对照组。上述研究表明，C5基因与EMs存在一定关联，可能在其发生发展过程中起重要作用。

3.5 C7 Ahn等[22]比较EMs组异位子宫内膜组织和对照组中C7基因的表达，发现C7在异位组织中过表达。有研究利用全面的免疫基因组分析在EMs患者及EMs相关性卵巢癌(endometriosis-associated ovarian cancer, EAOC)患者中表明，C7基因的表达较无EMs的患者显著增高，利用具有Kras和Pten基因条件性突变的三重转基因MUC1/Kras/Pten小鼠建立了一个新的原代卵巢表面上皮来源的小鼠卵巢癌细胞系(MKPOSE)，证实了Kras和Pten肿瘤驱动通路的激活导致上皮细胞C7的上调从而促进细胞增殖，敲除C7或者加入抑制Kras和PI3K通路的抑制剂(AZD6422或BEZ235) ，细胞的增殖都受到明显的抑制，敲除C7与任何一种抑制剂联合使用均表现出额外的抑制作用。首次揭示了肿瘤起始事件与补体免疫监视之间的联系，并指出这一途径是EAOC诊断、治疗和早期预防的潜在靶点[27]。

3.6 MAC 以往研究表明，EMs组腹腔液和血清MAC水平均高于非EMs组，EMs晚期患者血清MAC浓度升高尤为明显，并发现EMs组腹腔液和血清MAC浓度之间在统计学上呈正相关(r=0.74,P<0.01)[18]。MAC与S蛋白(卵黄连蛋白)的复合物是末端补体复合物的非溶解形式，不能结合到细胞表面，因此不能溶解细胞膜并导致细胞死亡。EMs患者中较高水平的MAC可能是防止细胞死亡和促进腹膜腔异位内膜细胞存活的因素之一。然而一项研究采用ELISA法得出EMs组与非EMs组腹腔液中MAC的浓度不存在明显差异[28]。上述研究结果存在差异，可能与研究人员例数、患者人群不同有关，因此MAC与EMs之间关系尚需更深入研究。

C6作为MAC的重要组成部分，其介导了调理反应。Karadadas等[29]选择71例采取术前1天、术后第1天、术后第7天外周血血清的EMs患者，与77例只采取1次外周血血清的对照组使用ELISA法检测，发现早期(r-ASRMⅠ～Ⅱ期)EMs患者血清C6蛋白水平明显高于对照组，并发现一组术前平均血小板体积(mean platelet volume, MPV)水平高的EMs患者(n=29)，其C3a和C6水平在所有测量时间点均显著高于对照组，表明补体途径和MPV之间可能存在干扰，并且两者之间干扰可能参与了EMs的发生。上述结果表明，MAC活性在EMs疾病发生阶段可能非常活跃，可猜想其一定程度上介导了EMs的发生发展过程。

3.7 MBL MBL与EMs的关系存在争议。有研究表明[30]，采用ELISA法测定EMs组与对照组血清MBL的浓度，得出EMs组血清MBL浓度与对照组比较差异无统计学意义。但Sikora等[13]研究发现，EMs组腹腔液中MBL浓度明显高于非EMs组，特别是EMs早期阶段的浓度高于晚期阶段，且EMs组的 MBL/C1INH 比值显著低于对照组，早期EMs患者MBL/C1INH 比值显著高于晚期EMs。然而EMs组腹腔液中C1q/C1INH 比值显著高于对照组，同样观察到早期EMs高于晚期EMs，C1q/C1INH和MBL/C1INH比值差异，可能意味着在这些患者中有一条更活跃的经典路径。无论哪种方式，这2个比例的异常都可能导致EMs患者腹腔免疫稳态的破坏。2项研究结果不同可能与测试样本不同有关，免疫系统的最大变化局限在腹腔内，因此外周血液的变化可能无法检测到。MBL途径在EMs疾病发生发展中的作用存疑，仍需进一步研究。

3.8 其他蛋白质 Ahn等[22]对其他补体蛋白的基因表达进行了研究，C2、C8A、CFB、CFH和CFI在EMs的异位子宫内膜中的表达高于对照组，相反C4BPA在异位子宫内膜中的表达低于对照组。有报道比较EMs、EAOC和正常子宫内膜患者的基因表达模式，发现在EMs、EAOC患者中CFB、CFD和CFH基因过度表达，而MASP-1基因的表达下调[27]。这些研究提供了EMs的补体分子特征，且说明了补体系统是EAOC中最显著的免疫调节失调途径。重要的是，补体在浆液性卵巢癌中不是最重要的途径，进一步表明卵巢癌组织类型之间的异质性，提示补体参与可能是EAOC的特征。未来这些补体分子也可能作为治疗EMs和EAOC的潜在药物靶点。

4 补体免疫治疗EMs的可能性

现今对于EMs的治疗方案主要为外科手术及药物治疗。外科手术已被证明可以减轻一部分患者慢性盆腔疼痛，手术旨在彻底移除子宫内膜异位组织和解除粘连，但手术治疗效果受到外科医生手术熟练度影响。激素治疗旨在抑制全身或局部雌激素水平，从而抑制子宫内膜异位组织增殖和EMs慢性炎性反应进展。口服避孕药、联合或单独服用孕激素，作为一线治疗药物，广泛用于治疗痛经或慢性盆腔疼痛(无论是否合并EMs)。但是目前所有的EMs治疗方法均为抑制性疗法，而非根治性疗法。近年来人们将目光投向免疫疗法[10, 31]。

EMs患者中普遍存在补体系统的异常激活，抑制补体系统可能是治疗EMs的一种新方法。目前还没有直接作用于补体系统的治疗靶点，现今已有许多针对补体的选择性抑制剂用于治疗遗传性血管水肿、阵发性睡眠性血红蛋白尿等多种疾病[32-34]。

Eulizumab是一种C5靶向药物，已被用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿、非典型溶血性尿毒症、全身性重症肌无力和视神经脊髓炎，同时对于新型冠状病毒治疗和疫苗研发提供了一些新思路[9]，其在EMs的治疗中可能是有前景的。尽管在C5水平阻断补体激活可能会使C3激活(如C3a的形成)的所有效应暴露出来，而C3a的形成是EMs发病机制中的关键一步。AMY-101已被安全和成功地用于治疗1例新冠肺炎所致的严重急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[35]，它(和其他C3抑制剂)能够阻断C3的激活，可能是未来治疗EMs的新兴药物[34]。补体C3抑制剂用于EMs的治疗有2个潜在优势：(1)从炎性反应信号级联的开始就阻断了在EMs发病机制中起重要作用的炎性反应信号；(2)较低的iC3b产生将更少抑制自然杀伤细胞(natural killer cell, NK细胞)的细胞毒活性。EMs患者NK细胞的细胞毒活性降低与EMs的严重程度有关。补体免疫治疗可部分阻断或显著减少C5a和C3a诱导的巨噬细胞和肥大细胞在子宫内膜异位微环境中的激活。巨噬细胞是EMs发病机制中的主要免疫细胞[36]，EMs患者的病灶中M2巨噬细胞占主导地位，M2巨噬细胞会促进EMs患者异位子宫内膜细胞的增殖和血管生成。MC可能参与了EM的发展和进化，与EMs粘连和纤维化有很强的相关性。EMs患者腹腔液中高水平的C1q可诱导组织巨噬细胞向M2表型分化，从而促进EMs中的血管生成。因此，一种能够特异性阻断C1q的抑制剂在EMs治疗中可能很有意义[37]。

5 小结

EMs是导致不孕的常见慢性妇科疾病，给患者带来了沉重的身体负担、经济负担及社会心理负担。补体系统主要通过抗原—抗体结合的经典途径，将先天性免疫与适应性免疫相联结,参与外源性及内源性凝血途径变化，与TNF-α、IL-6等多种细胞因子及PI3K/AKT等各种信号通路相互协同或制约，从而激活更多脱颗粒肥大细胞与巨噬细胞分化,抑制NK细胞的细胞毒活性，从而形成复杂的炎性介质网络，扩大并加重炎性反应，参与了EMs发生发展的生理病理过程，进而造成慢性疼痛、不孕等症状。补体系统也是EAOC中最重要免疫途径，有潜在特异性，抑制补体系统可以抑制肿瘤细胞增殖和卵巢癌进展。但目前的实验结果均是在体外细胞或者动物模型上实现，没有人体相关的临床数据，且发展机制尚不完善，需更多实验研究完善其分子机制，了解其与EMs中如巨噬细胞等其他免疫细胞的调节关系。目前，药物和手术是治疗EMs的主要选择。然而，考虑到药物治疗导致的不良反应和手术后高复发率，从其他方面寻找治疗 EMs 的方法迫在眉睫。而针对补体的选择性抑制剂可能是不会抑制生殖功能的新型治疗方式。虽然尚不清楚补体的选择性抑制应用于临床时治疗效果及预后如何，但是这种新型靶向药物确实在治疗EMs上带来希望，未来的研究可以集中在寻找更多与此类似的治疗EMs的新药物靶点。