参苓白术散通过TLR4/MyD88通路对Lewis肺癌小鼠肿瘤凋亡的干预作用*

张云亭，刘羽茜，蒋宗蓥，董 秀，张 林，王靖宇，王艳杰

（辽宁中医药大学中西医结合学院，辽宁 沈阳 110847）

肺癌是近年来患病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一，对人类生命威胁极大。有资料表明，肺癌与长期吸烟有关，另外空气污染、职业暴露、遗传等也是肺癌的致病因素[1]。目前常用的肺癌治疗药物为铂类抗肿瘤药物[2]，但极易产生耐药性。单纯的更换化疗药物不仅无法解决问题，还会增加患者的毒副作用等不良反应。中药因为其多靶点效应及复方组成的多样性，在临床肿瘤治疗上获得了广泛应用。中医药治疗肿瘤、抗肿瘤耐药、预防转移复发等作为新的研究方向已成为近年新的研究热点[3-4]。肺癌的临床表现有咳嗽咳痰、咳血、胸痛等，并伴随炎性发热症状，炎症反应能够促进肿瘤的发生和发展。参苓白术散是“培土生金”的经典方剂，有实验表明参苓白术散对炎症反应有一定作用[5]。本课题组前期研究表明参苓白术散在细胞水平能够通过TLR4信号通路调控肿瘤炎症微环境，抑制肺癌细胞的增殖，因此本实验通过建立Lewis肺癌小鼠模型，进一步观察参苓白术散在体内通过TLR4/MyD88通路对Lewis肺癌小鼠肿瘤凋亡的干预效果和机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6周龄SPF级雄性C57小鼠40只，体质量18～22 g，购于常州卡文斯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2011-0003。于辽宁中医药大学动物实验中心SPF级动物房饲养，室温20～25 ℃，适应性喂养1周后开始实验。实验麻醉后处死小鼠。所有实验动物研究方法均符合辽宁中医药大学伦理委员会有关的动物实验研究指导原则，且获得本院动物护理和使用委员会批准审核。

1.2 细胞株 小鼠Lewis肺癌细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.3 药物和试剂 参苓白术散（北京同仁堂有限公司，批号：16101054）；顺铂（齐鲁制药有限公司，批号：1W2A1301004B）；TLR4抗体（批号：YT0744）、MyD88（批号：YT2928）、Cleavedcaspase 3（批号：9664T）和二抗（批号：A23920）均购自美国CST公司；SABC试剂盒（批号：SA1050）、DAB显色试剂盒（批号：AR1021）均购自武汉博士德生物工程有限公司；TUNEL原位凋亡检测试剂盒（批号：KGA702）、全蛋白抽提试剂盒（批号：KGP150）、BCA蛋白含量检测试剂盒（批号：KGPBCA）、预染蛋白分子量Maker（批号：KGM441）、SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒（批号：KGP113）、ECL检测试剂盒（批号：KGP1121）均购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.4 主要仪器 YrdimesSW07D0567蛋白印迹仪（威泰克有限公司）；EG1150C型包埋机、LKB-1超薄切片机、HI1220型烘片机（德国LEICA）；JEM-1011BX51型OLYMPUS显微镜（日本OLYMPUS）；ELITE300PLUS E5W0541基础电泳仪电源（威泰克有限公司）；5415C高速冷冻离心机（德国Eppendorf）；RM2235型手动石蜡切片机、UV-2540分光光度计（日本SHIMAZDU）；THZ-312台式恒温振荡器（上海精宏实验设备有限公司）；BL310/BL21S分析天平（德国Sartorius）；DolphinChemi－PlusIDPK1012012凝胶成像分析系统（威泰克有限公司）。

1.5 造模与分组 常规培养小鼠肺癌Lewis细胞，达到一定数量后收集细胞并计数，制作细胞悬液。雄性C57小鼠40只，采用腋窝皮下接种肺癌Lewis细胞悬液法建立Lewis肺癌小鼠模型。每只小鼠右侧腋窝皮下接种浓度为1×107个/mL的细胞悬液0.1 mL；待形成肿瘤组织后每日用游标卡尺观察测定肿瘤直径，待其直径达到50 mm3视为Lewis肺癌小鼠模型成功建立。将造模成功小鼠随机分Lewis肺癌组、顺铂组、中药组和中药+顺铂组，每组10只。

1.6 实验给药 按实验方法[6]分别对4组进行周期为14 d的灌胃或腹腔注射给药。顺铂组小鼠给予腹腔注射顺铂（5 mg/kg），1次/周，共2次。中药组根据人的使用剂量（18 g/70 kg），按照体表面积折算法进行人和小鼠等效剂量换算给予参苓白术散（9.36 g/kg），1次/d，连续灌胃14 d；Lewis肺癌组小鼠灌胃给予等量生理盐水；中药+顺铂组小鼠给予参苓白术散（9.36 g/kg）连续灌胃14 d，1次/d，同时腹腔注射顺铂（5 mg/kg），1次/周，共2次。

1.7 观察指标

1.7.1 小鼠体质量、肿瘤质量和肿瘤增长抑制率 实验前、造模成功、治疗第5天、治疗第10天和治疗第14天分别测定小鼠体质量；治疗14 d后麻醉处死小鼠，手术剥取肿瘤组织进行质量称量，计算肿瘤生长抑制率。肿瘤生长抑制率（%）=（模型组平均肿瘤质量-给药组平均肿瘤质量）/模型组平均肿瘤质量×100%。

1.7.2 TUNEL染色法测定小鼠肺癌肿瘤组织凋亡的情况切片常规脱蜡，水合，二甲苯浸泡，再分别浸泡于无水乙醇中5 min；90%乙醇中2 min；80%乙醇中2 min；70%乙醇中2 min；蒸馏水中2 min。加20 μg/mL不含DNase的proteinase K，37 ℃反应20 min。PBS浸洗，3%的H2O2-甲醇溶液处理阻断内源性过氧化物酶。PBS浸洗，滴加生物素标记液50 μL，37 ℃孵育1 h。PBS浸洗，滴加0.1 mL标记反应终止液，室温孵育，PBS浸洗。加Streptavidin-HRP工作液50 μL，室温孵育，PBS浸洗。DAB显色。光学显微镜下观察拍照，进行结果分析。蓝色为正常细胞，棕黄色为凋亡细胞。计算细胞凋亡指数（AI）。细胞凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.7.3 免疫组化法测定肿瘤组织TLR4、MyD88和Caspase-3蛋白表达水平 切片消除内源性过氧化物酶，室温封闭10 min，PBS浸洗，封闭，室温孵育20 min。加一抗50～100 μL，37 ℃的湿盒中孵育2 h后，PBS浸洗。滴加增强剂50 μL，37 ℃孵育30 min后，PBS浸洗。加二抗，37 ℃孵育，PBS浸洗。DAB溶液显色，镜下观察染色深浅，染好后用自来水轻柔冲洗，复染，蒸馏水冲洗，自来水返蓝，梯度脱水封片。光学显微镜下观察蛋白的表达情况，取3个高表达区域拍照保存并采用Image J软件测定光密度值，进行统计分析。

1.7.4 Western blotting法测定组肿瘤组织TLR4、MyD88和cleaved-Caspase-3蛋白表达水平 肿瘤组织加入预冷Lysis Buffer裂解液，充分研磨，离心分离上清，获得全蛋白提取物，采用BCA法进行总蛋白定量。选择合适浓度的凝胶，配制SDS-PAGE的分离胶和浓缩胶，上样进行电泳分离、转膜，将蛋白转移到PVDF膜上。加入5%脱脂奶粉，摇床振荡1～2 h进行封闭。加一抗（1∶1 000），4 ℃摇床振荡孵育过夜。TBST洗涤，加二抗，室温摇床振荡反应1～2 h，TBST洗膜3次。ECL化学发光试剂盒显色，凝胶成像仪成像拍照，Gel-ProAnalyzer4 软件进行数据分析，计算目的蛋白和内参的灰度，进行统计分析。

1.8 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料采用（）表示，符合正态分布和满足方差齐性，采用单因素方差分析；组间比较采用LSD法分析，重复测量数据比较采用重复测量方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。统计图采用GraphPad Prism7.0软件进行绘制。

2 结 果

2.1 各组小鼠体质量、肿瘤质量及肿瘤生长抑制率比较 造模前和造模成功后各组小鼠体质量无明显差异（P＞0.05）。治疗第5天、第10天和第14天时，Lewis肺癌组和中药组小鼠体质量升高，顺铂组和中药+顺铂组小鼠体质量降低。与Lewis肺癌组比较，顺铂组小鼠体质量明显降低（P＜0.01），中药组小鼠体质量无明显差异，中药+顺铂组小鼠体质量明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。（见图1）

图1 各组小鼠体质量比较（，n=10）

与Lewis肺癌组比较，顺铂组、中药组和中药+顺铂组小鼠肿瘤质量明显降低（P＜0.01）；且中药+顺铂组小鼠肿瘤质量明显低于顺铂组、中药组（P＜0.01）；顺铂组小鼠肿瘤生长抑制率为38.59%，中药组小鼠肿瘤生长抑制率为30.14%，中药+顺铂组小鼠肿瘤生长抑制率为44.51%。（见图2）

图2 各组小鼠肿瘤质量比较（，n=10）

2.2 各组小鼠肿瘤组织细胞凋亡结果比较 TUNEL染色肿瘤组织，棕色为凋亡细胞。Lewis肺癌组小鼠肿瘤组织中仅有少量凋亡细胞，顺铂组、中药组和中药+顺铂组小鼠肿瘤组织凋亡细胞数量则明显增多。（见图3）

图3 各组小鼠肿瘤组织细胞凋亡情况（TUNEL染色，标尺=20 μm）

顺铂组、中药组和中药+顺铂组小鼠肿瘤细胞凋亡指数明显高于Lewis肺癌组（P＜0.01），且中药+顺铂组小鼠肿瘤细胞凋亡指数明显高于顺铂组、中药组（P＜0.01）。（见表1）

表1 各组小鼠肿瘤细胞凋亡指数比较（）

表1 各组小鼠肿瘤细胞凋亡指数比较（）

注：与Lewis肺癌组比较，aP＜0.01；与顺铂组比较，bP＜0.01；与中药组比较，cP＜0.01

2.3 各组小鼠肿瘤组织细胞中TLR4、MyD88和Caspase-3蛋白表达水平比较 TLR4、MyD88和Caspase-3阳性细胞显示为棕色。免疫组化结果显示：与Lewis肺癌组比较，中药组、顺铂组和中药+顺铂组小鼠肿瘤组织中TLR4和MyD88阳性细胞数量明显减少，平均光密度值明显降低（P＜0.01），Caspase-3阳性细胞数量明显增加，平均光密度值明显升高（P＜0.01）。与顺铂组、中药组比较，中药+顺铂组中TLR4、MyD88和Caspase-3蛋白表达水平的变化更明显（P＜0.01）。（见图4～5）

图4 各组小鼠肿瘤组织细胞中TLR4、MyD88 和Caspase-3 蛋白表达免疫组化图（标尺=200 μm）

图5 各组小鼠肿瘤细胞TLR4、MyD88 和Caspase-3 蛋白平均光密度值比较（，n=10）

2.4 各组小鼠肿瘤组织中TLR4、MyD88、cleaved-Caspase-3蛋白表达比较 Western blotting结果显示：与Lewis肺癌组比较，顺铂组、中药组和中药+顺铂组小鼠肿瘤组织中TLR4和MyD88蛋白表达水平明显降低（P＜0.01），cleaved-Caspase-3蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）。中药+顺铂组小鼠肿瘤组织中TLR4、MyD88蛋白表达水平低于顺铂组、中药组，Caspase-3蛋白表达水平高于顺铂组、中药组（P＜0.01）。（见图6～7）

图6 各组小鼠肿瘤组织细胞中TLR4、MyD88和cleaved-Caspase-3 蛋白表达Western blotting 图

图7 各组小鼠TLR4、MyD88 和cleaved-Caspase-3 蛋白相对表达量比较（，n=10）

3 讨 论

肺癌早期症状不明显，大部分患者被确诊时已是晚期。从中医学角度分析，肺癌主要发病部位在肺，可分型为气阴两虚、肺脾气虚、阴虚毒热和气滞血瘀四种[7]。脾属土，肺属金，脾肺两脏关系密切，培土生金法能够治疗肺系疾病。参苓白术散出自《太平惠民和剂局方》，是中医经典培土生金方，由人参、茯苓、白术、白扁豆、山药、砂仁、陈皮、莲子、薏苡仁、桔梗、炙甘草等药物组成，具有益气健脾、化湿止泻的作用[8]。方中人参大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血。山药补脾养胃，生津益肺，益气养阴。桔梗宣肺祛痰、利咽排脓，在方中载药上行，兼保肺气。临床上参苓白术散常用于治疗肺脾气虚、虚劳肺损引起的多种肺系疾病[9]。近年来参苓白术散又逐渐应用于肿瘤放化疗后，减轻胃肠道反应症状，提高患者生活质量[10-11]。因此进一步研究参苓白术散对肺癌的干预效果和机制具有重要临床意义。

现代医学认为炎症在肺癌的各个阶段均有体现，持续的炎症可以促使炎症血管的生成从而形成炎症微环境，在这种微环境中肺癌细胞更容易增殖和扩散，明显增加了肺癌的转移率。目前已有研究表明可以通过抑制炎症微环境来抑制肺癌肿瘤细胞的增殖[12]。TLR4/MYD88通路是典型的炎症通路之一。TLR4分布在细胞膜上，是一类参与非特异性免疫的重要蛋白分子。MyD88作为重要的转导蛋白，可以被TLR4募集，在依赖的信号通路中有着关键作用[13]。TLR4信号通路激活，能够通过TLR结构域传递给其依赖的MyD88，促进IRAK4和IRAK1磷酸化，最终激活IκB激酶和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），促使IL-1、IL-6、IL-8等分泌增加，引起炎症反应[14]。本课题组的前期研究结果表明，在体外实验中参苓白术散含药血清能够下调TLR4的表达，从而干预肺癌SPCA1细胞的增殖。

细胞凋亡是近年的研究热点。常见的两条凋亡途径为死亡受体介导的外源凋亡通路途径和线粒体介导的内源性凋亡通路途径[15]。参与细胞凋亡途径的主要蛋白有Caspase家族、衔接蛋白、IAPs家族和Bcl-2家族[16]。其中Caspase-3被激活后细胞凋亡不可避免，被认为是影响凋亡的关键蛋白酶[17]。Caspase-3作为多种凋亡途径共同的下游效应部分，是细胞凋亡级联反应的必经之路，在细胞凋亡中起重要调控作用，是评价肿瘤治疗药物效果的重要指标之一[18-19]。本课题组前期体外实验表明培土生金法能够通过调控人肺腺癌SPCA1细胞Caspase-3的表达从而促进肿瘤细胞的凋亡[20]，体内实验表明培土生金法能够调控Lewis肺癌小鼠肿瘤组织Bax和Bcl-2表达，促进肿瘤组织凋亡[21]。因此，本实验通过建立Lewis肺癌小鼠模型，通过体内实验观察肿瘤组织的凋亡情况和Caspase-3、TLR4、MyD88蛋白表达水平，进一步探索其在体内治疗肺癌的信号转导机制。

本实验结果显示：经培土生金法复方参苓白术散干预后，Lewis肺癌小鼠肿瘤质量降低，肿瘤抑制率达到30.14%，参苓白术散联合顺铂干预肿瘤抑制率可以达到44.51%，和单独使用顺铂和参苓白术散比较，能够提高肿瘤抑制率。并且参苓白术散能促进Caspase-3的蛋白表达水平，促进肿瘤细胞的凋亡，这可能与下调炎症相关因子TLR4和MyD88的蛋白表达水平有关。

综上所述，参苓白术散能通过TLR4/MyD88信号通路影响Lewis肿瘤小鼠肿瘤生长的微环境，从而促进肿瘤细胞的凋亡，为临床培土生金法联合化疗药物治疗肺癌提供了实验依据。