电子鼻结合气相-离子迁移谱联用技术分析兰茂牛肝菌气调贮藏期间挥发性风味物质的变化

孙达锋，胡小松，张沙沙

（1.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南昆明 650221；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

兰茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica）属牛肝菌科（Boletaceae），牛肝菌属（Boletus）[1]，俗称“红葱”，盛产于云南、贵州等地，深受当地人喜爱。兰茂牛肝菌一直被误认为双色牛肝菌（Boletus bicolorRaddi）[2]、华美牛肝菌（Boletus speciosus）[3]，直到2016 年Wu 等[1]结合现代分子手段，才将其定名为兰茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica）。新鲜兰茂牛肝菌口感爽脆，并伴有奇鲜，虽有微毒性，但经适当加工后口味奇特；兰茂牛肝菌营养组成均衡，富含蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质、多糖等多种功效成分[4]。

目前关于兰茂牛肝菌的研究较少，苏璐等[5]研究了兰茂牛肝菌含药血清对免疫系统的调节作用；杨利梅等[6]研究了食用外共生菌根真菌兰茂牛肝菌纯培养条件下不同发育时期的核相。兰茂牛肝菌属于呼吸跃变型，采收后仍然进行新陈代谢活动，导致其失重、萎焉、风味改变甚至腐烂变质，降低了兰茂牛肝菌的食用价值和商品价值。兰茂牛肝菌常用的保鲜技术是冷藏保鲜、速冻保鲜、保鲜剂保鲜等，这些保鲜技术虽然在一定程度上延长了兰茂牛肝菌的贮藏期，但远远不能满足人们对营养、健康、美味的要求。而气调贮藏保鲜技术是一种物理保鲜技术，具有保鲜时间长、效果明显、无任何污染等优点，但鲜用于兰茂牛肝菌的保鲜。目前，关于食用菌挥发性风味物质的研究主要采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）、全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC-TOFMS）、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱嗅闻（GC-O）等，也有采用气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）及电子鼻等[7−10]。电子鼻是仿生物嗅觉系统，快速、重复性好、可以做到无损检测，近年来广泛用于肉类、酒类、果蔬[11−14]等农产品检测。GC-IMS 技术样品处理简单，直接顶空进样，能够最大程度保留样品自身风味，分辨率高、灵敏度高，结果以直观可视化的指纹图谱呈现不同样品的风味差异，目前已广泛应用于食品品质控制、粮油贮藏、医疗诊断等领域[15−20]。但有关兰茂牛肝菌气调保鲜及挥发性风味成分的研究，均未见报道。

本文以兰茂牛肝菌鲜品为研究对象，采用电子鼻结合气相-离子迁移谱联用技术分析兰茂牛肝菌气调贮藏期间的挥发性风味物质，为快速判断兰茂牛肝菌新鲜度及其调味品的研发提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜的兰茂牛肝菌 采集于云南省玉溪市哀牢山，采集后全程冷链运回中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所保存，挑选大小一致、无机械损伤的子实体用于实验。

PEN3 电子鼻 德国AIRSENSE 公司；Flavour Spec®风味分析仪 德国G.A.S 公司；YGCA 气调试验箱 北京阳光亿事达科技有限公司；BSC-250 恒温恒湿箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂司；KMS-50 试验定制型真空预冷机 东莞市科美斯制冷设备有限公司；HW-XS-I-5G 臭氧发生器 广州市环伟环保科技有限公司；MXT-5 色谱柱 美国RESTEK 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 参考张燕等[21]和薛伟等[22]处理方法，并修改，将9 kg 新鲜兰茂牛肝菌，在真空预冷机中进行预冷，温度为3 ℃，时间为10 min，进行臭氧杀菌处理10 min（臭氧浓度为200 μg/L），放入气调试验箱：气体成分为O26%、CO210%，温度为（5±0.5）℃，湿度为90%，每隔6 d 随机取样检测。1 号、2 号、3 号、4 号和5 号样品分别代表新鲜兰茂牛肝菌贮藏第1、7、13、19 和25 d 的样品。

1.2.2 电子鼻分析 样品间隔时间为1 s，冲洗时间为60 s，调零时间为10 s，测定时间为100 s，载气流速为400 mL/min，环境温度为18～20 ℃[23]。本研究选取数据较平稳的50～52 s 用于后续分析，每个处理重复测定3 次。PEN3 电子鼻由10 个不同传感器阵列组成，各传感器代表的物质种类及性能描述见表1。

表1 传感器代表的物质种类及性能描述Table 1 Material type and performance description represented by sensor

1.2.3 GC-IMS 分析方法 参考谢建春[24]的方法，并略作修改。样品处理：取3.0 g 样品，置于20 mL顶空瓶中，40 ℃孵化15 min 后进样500 μL，进样方式是顶空进样，进样针温度为85 ℃，孵化转速为500 r/min。

色谱柱：MXT-5；石英毛细管柱（15 m×0.53 mm，0.5 μm），载气/漂移气为高纯N2；载气流速分析时间为20 min，柱温为 60 ℃。载气流量0～2 min 为2 mL/min，2～20 min 为2～150 mL/min。漂移气流量为150 mL/min，IMS 探测器温度为45 ℃。

1.3 数据处理

电子鼻数据分析：采用Winmuster 分析软件对采集到的数据进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）。

GC-IMS 数据分析：利用FlavourSpec®风味分析仪配套的分析软件（VOCal、Gallery Plot、Reporter、DynamicPCA 等）对图谱进行差异分析，并通过应用软件内置的IMS 数据库和NIST 数据库对物质进行定性分析。

采用Excel 2007 软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 电子鼻对兰茂牛肝菌的挥发性风味响应

2.1.1 兰茂牛肝菌气调贮藏期间风味雷达指纹图谱

采用电子鼻对兰茂牛肝菌气调贮藏期间5 个样品的香气轮廓进行分析。PEN3 电子鼻的10 个传感器对气体敏感度不一样，当传感器与气体接触时，相对电导率的比值G/G0与气体浓度呈正比，当G/G0>1时，说明气体浓度大；当G/G0≤1 时，说明没有响应气体或气体浓度低于检测限[23]。由图1 可以看出，电子鼻的10 个传感器对不同贮藏期兰茂牛肝菌的挥发性风味物质均有响应，并且响应强度各不相同，所以利用电子鼻判断兰茂牛肝菌气调贮藏期间新鲜度具有可行性。由图1 可以看出，W5S（氮氧化合物敏感）、W6S（氢气敏感）、W5C（烷烃芳香成分敏感）、W2S（醇类敏感）传感器的G/G0高于其他6 个传感器；不同贮藏时间的兰茂牛肝菌对10 个传感器的反应信号强度不同，其中，气调贮藏第1 d 和第13 d 的强度明显高于其他贮藏天数，说明气调贮藏第1 d 和第13 d 的兰茂牛肝菌的挥发性风味成分的种类和含量较高。另外，其他贮藏时间的兰茂牛肝菌区分不明显，反应信号强度差别较小，而构建主成分分析图可直观区分。

图1 兰茂牛肝菌气调贮藏期间风味雷达指纹图谱Fig.1 Radar map of flavor components of L. asiatica during controlled atmosphere storage

2.1.2 基于电子鼻方法的主成分分析 主成分分析（PCA）将电子鼻传感器提取的多个指标的信息进行数据降维处理，提取主要因子进行线性分析，观察比较兰茂牛肝菌气调贮藏期间的PCA 值在空间的分布差异[25−26]。由图2 对不同气调贮藏时间的兰茂牛肝菌进行PCA 分析可以看出，第1 主成分、第2 主成分贡献率分别为94.08%、5.50%，总贡献率为99.58%，不同气调贮藏时间的5 个样品完全不重叠，说明兰茂牛肝菌气调贮藏期间的气味有区别，可以利用电子鼻来区分。贮藏第1 d 和第13 d 的兰茂牛肝菌在第1 主成分方向比较接近，而贮藏第7、19、25 d的兰茂牛肝菌在第1 主成分和第2 主成分方向都比较接近，这可能与兰茂牛肝菌的后熟作用有关。

图2 基于电子鼻不同气调贮藏时间的兰茂牛肝菌PCA 图Fig.2 PCA of L. asiatica during controlled atmosphere storage using electronic nose

2.1.3 基于电子鼻方法的LDA 分析 LDA 是模式识别的经典算法，本质上是一种投影，是将一个高维的点投影到一条高维的直线上，投影过程中尽量使同类别的数据点紧凑，而不同类别之间数据点的距离更大。由图3 对不同气调贮藏时间的兰茂牛肝菌进行LDA 分析可以看出，第1 主成分、第2 主成分贡献率分别为95.94%、3.32%，总贡献率为99.26%，贮藏第19～25 d 的兰茂牛肝菌与贮藏第1～13 d 的兰茂牛肝菌距离比较远，说明气调贮藏第13 d 左右是新鲜度变化的拐点。

图3 基于电子鼻不同气调贮藏时间的兰茂牛肝菌LDA 图Fig.3 LDA of L. asiatica during controlled atmosphere storage using electronic nose

2.2 GC-IMS 检测结果分析

2.2.1 兰茂牛肝菌气调贮藏期间GC-IMS 二维谱图分析 图4 为兰茂牛肝菌气调贮藏期间1 号（贮藏第1 d）、2 号（贮藏第7 d）、3 号（贮藏第13 d）、4 号（贮藏第19 d）、5 号（贮藏第25 d）样品的GC-IMS二维谱图。其中，横坐标代表迁移时间（ms），1.0 处红色垂直线为反应离子峰，每个样品的迁移时间约2.04 ms，峰右侧的每个点代表一种挥发性物质，点的面积及颜色代表该物质含量的大小，颜色越深，代表挥发性物质的含量越高，颜色越浅，则反之；纵坐标代表保留时间（s）。由图4 可以看出，1 号样品和3 号样品的红色点和浅蓝色点的数量和面积明显高于2、4、5 号样品，说明兰茂牛肝菌贮藏第1 d 和第13 d的挥发性物质明显高于其它贮藏时间。

图4 兰茂牛肝菌气调贮藏期间的二维GC-IMS 谱图（俯视图）Fig.4 Two-dimensional GC-IMS spectra in L. asiatica during controlled atmosphere storage (top view)

2.2.2 兰茂牛肝菌气调贮藏期间挥发性物质Gallery Plot 指纹谱图 为进一步对比兰茂牛肝菌气调贮藏期间挥发性物质的差异性，利用GC-IMS 对兰茂牛肝菌气调贮藏期间挥发性物质进行分析，采用Gallery Plot 插件绘制了1、2、3、4、5 号样品的挥发性物质的离子迁移指纹图谱，每个样品做三次平行，见图5。并采用GC-IMS 应用软件内置的IMS 数据库和NIST 数据库对兰茂牛肝菌贮藏期间挥发性物质进行定性分析，如表2 所示。

由图5 和表2 可以看出，GC-IMS 在兰茂牛肝菌气调贮藏期间共检出50 种挥发性物质，其中包括16 种醛类、10 种醇类、6 种酮类、1 种酸类、1 种酯类和16 种未能识别的化合物；贮藏第1 d 和第13 d时挥发性风味物质种类最多，含量最丰富。有研究表明，八碳挥发性物质是构成食用菌风味的主要成分，它们主要由亚油酸经脂肪氧化酶催化而来[27−28]。兰茂牛肝菌气调贮藏期间有7 种八碳挥发性化合物，主要是1-辛烯-3-醇及其二聚体、3-辛酮及其二聚体、苯乙醛、（E）-2-辛烯醛及其二聚体，其中，1-辛烯-3-醇及其二聚体变化不明显，3-辛酮二聚体、苯乙醛呈先降低后升高的趋势，3-辛酮呈逐渐升高的趋势，贮藏第13 d 稍有回落，（E）-2-辛烯醛及其二聚体呈先降低后升高再降低的趋势。含硫化合物是影响食用菌整体风味的另外一个重要组成成分，兰茂牛肝菌气调贮藏期间有3 种含硫化合物，包含3-甲基硫丙醛单体、3-甲基硫丙醛二聚体和甲硫醇，前两者呈先升高后降低的趋势，后者呈先降低后升高的趋势。

图5 兰茂牛肝菌气调贮藏期间挥发性物质的Gallery Plot 指纹图谱Fig.5 Gallery Plot of volatile compounds in L. asiatica during controlled atmosphere storage

表2 GC-IMS 测得的兰茂牛肝菌气调贮藏期间挥发性物质Table 2 Volatile compounds of L. asiatica during controlled atmosphere storage

由图5 可以看出，兰茂牛肝菌气调贮藏期间挥发性物质1-辛烯-3-醇及其二聚体、异戊醇、异丙醇及其二聚体、2-甲基-1-丁醇变化趋势不明显，甲硫醇、2-甲基-1-戊醇、5-甲基-2-呋喃甲醛、（E）-2-己烯-1-醇呈先降低后升高的趋势；醛类物质一般发生斯特勒克尔（Strecker）降解或脂质氧化产生，香味阈值一般较低[29−30]，由图5 可以看出，醛类物质在兰茂牛肝菌气调贮藏期间含量变化较明显，兰茂牛肝菌气调贮藏期间（E）-2-辛烯醛及其二聚体、3-甲基硫丙醛及其二聚体呈较明显的降低趋势；庚醛、己醛及其二聚体、苯乙醛、2-甲基丙醛、2-甲基丁醛，呈先降低后升高的趋势；3-甲基丁醛及其二聚体、苯甲醛及其二聚体、（E）-2-庚烯醛及其二聚体呈先升高后降低的趋势，贮藏第13 d 左右达到峰值；酮类物质具有独特的香味，香味阈值也较低[31−32]，兰茂牛肝菌气调贮藏期间3-辛酮及其二聚体、2-庚酮及其二聚体、2,3-丁二酮、二氢-2（3h）-呋喃酮呈先降低后升高的趋势；丙酸、甲酸乙酯呈逐渐降低的趋势。兰茂牛肝菌气调贮藏期间醛类的种类和含量明显减少，酮类种类和含量在增加，苯乙醛和丙酸可作为兰茂牛肝菌气调贮藏期间特征性挥发性物质，苯乙醛呈甜香、浓郁的玫瑰花香，丙酸呈酸味果香[33−34]。

2.2.3 基于GC-IMS 的兰茂牛肝菌气调贮藏期间挥发性物质PCA 分析 为更直观分析兰茂牛肝菌气调贮藏期间挥发性风味物质的变化，运用PCA 插件程序对1～5 号样品作聚类分析，见图6。

图6 基于GC-IMS 的气调贮藏期间兰茂牛肝菌的PCA 分析Fig.6 PCA analysis of L. asiatica during controlled atmosphere storage based on GC-IMS

由图6 可以看出，不同气调贮藏期的兰茂牛肝菌的挥发性物质没有明显的重叠区域，说明采用GC-IMS 技术结合主成分分析，可以区分不同气调贮藏期的兰茂牛肝菌，也就是可以区分兰茂牛肝菌的新鲜度。PC1 和PC2 的累计贡献率达69%，气调贮藏第1 d 和第13 d 的兰茂牛肝菌在第1 主成分方向比较接近，样品2 与样品4 距离比较近，气调贮藏13 d的样品距离其它样品较远，说明其挥发性物质与其他样品明显不同，可能与兰茂牛肝菌的后熟作用有关，这与电子鼻检测结果一致。

3 讨论与结论

采用电子鼻和GC-IMS 技术从宏观和微观上对气调贮藏期间的兰茂牛肝菌的挥发性物质进行分析。电子鼻可以有效区分不同气调贮藏时间的兰茂牛肝菌，气调贮藏13 d 左右是兰茂牛肝菌新鲜度变化的拐点，贮藏第13～25 d 兰茂牛肝菌仍可食用，但风味欠佳。GC-IMS 构建的香气轮廓共有50 种挥发性香气成分被检出，其中包括包含16 种醛类、10 种醇类、6 种酮类、1 种酸类、1 种酯类和16 种未被识别，贮藏第1 d 和13 d 时挥发性物质的种类和含量最高。兰茂牛肝菌气调贮藏期间挥发性物质的种类和含量（主要为醛酮类物质）随着贮藏时间的延长而改变，醛类化合物的种类和含量明显减少，酮类化合物种类和含量增加，以醛类和醇类为主的八碳化合物挥发性香气成分对兰茂牛肝菌的香气贡献最大，苯乙醛和丙酸可作为兰茂牛肝菌气调贮藏期间特征性挥发性物质。

电子鼻和GC-IMS 联用可快速直观地对不同气调贮藏时间的兰茂牛肝菌进行差异分析，并可快速判断兰茂牛肝菌的新鲜度。本研究建立了兰茂牛肝菌不同贮藏期（新鲜度）挥发性物质指纹图谱，可为判断兰茂牛肝菌新鲜度提供一定的理论依据。