基于气相离子迁移谱技术分析杜仲叶茯砖茶加工过程中挥发性成分

曾 桥，吕生华，段 洁，边文文，刘 静，孙 敏，张静娴，刘 媛，杨文娟，冯小龙，余郑绿

（1.陕西科技大学轻工科学与工程学院，陕西西安 710021；2.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安 710021；3.陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安 710048；4.通化唐亦舒食品有限公司，吉林通化 134000；5.陕西朴道茶业股份有限公司，陕西西安 713700）

茯砖茶为黑茶类后发酵茶[1]，具有金花普茂，菌香浓郁，汤色红浓，口感醇厚的特征[2]，常以黑毛茶为原料，经筛选、渥堆、气蒸、压制成型、发花干燥和陈化等一系列复杂工艺加工而成[3]。近年来，以茯砖茶、普洱茶等为代表的发酵茶类不仅风味和口感良好，而且还具有降脂减肥、降糖、抗肿瘤和抑菌等多种保健功能[4−5]，受到消费者的广泛青睐。研究表明，茯砖茶的特殊加工工艺有效地降低了茯砖茶的涩味和苦味，促进了醇和口感和红浓汤色的形成，同时赋予了茯砖茶特有的药草香、木香、花果香的“菌花香”香气，极大地提高了产品的风味和品质[6]。

杜仲叶为杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliver）的干燥叶[7]，长期以来作为中药材和保健食品的原料，杜仲叶含有丰富的多糖、黄酮、氨基酸、多酚、绿原酸、苯丙素、环烯醚萜类等[8−11]活性成分，具有降压、降脂、补肾、抗肿瘤和增强免疫等作用[8,12−14]。近年来，结合传统饮食习惯和地方需求，国家卫计委开展了将杜仲叶按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点工作，这将极大的促进杜仲叶资源的开发和利用。当前，杜仲叶在食品中的开发主要包括杜仲叶茶、保健饮料[15]和杜仲叶醋[16]等，其中，杜仲叶茶在市场上最为常见。然而现有的杜仲叶茶普遍具有青辛味较重、茶汤发绿或发黑、滋味和口感欠佳等缺点，基于此，本文前期以杜仲叶茶为原料，采用泾阳茯砖茶加工工艺制备了杜仲叶茯砖茶，不仅改善了杜仲叶茶的风味和口感，而且保健功能较传统茯砖茶更为突出，具有较好的市场前景。

气相色谱-离子迁移谱法（GC-IMS）是一种新兴的气相分离检测技术，因具有样品制备简单、灵敏度高、分辨率高、操作简便、分析高效和风味物质可视化等[17]特点而广泛应用于酒、中药、海产品、茶叶、乳制品等[18−20]行业。GC-IMS 在茶叶方面主要用于品种鉴别、风味研究、真伪鉴定以及质量评价等，如金文刚等[21]基于GC-IMS 技术对不同绿茶产地制作的“汉中仙毫”绿茶气味成分进行了特征分析，为“汉中仙毫”绿茶品质控制、产地质量区分与品牌管理提供了依据，李俊杰等[6]采用GC-IMS 结合顶空固相微萃取（Headspace Solid-phase Microextraction, HSSPME） -气质联用技术（Gas Chromatography-mass Spectrometry, GC-MS），对手筑茯砖茶发花过程中的挥发性成分变化进行了研究，实现了不同加工阶段茯砖茶风味物质的区分。本研究采用GC-IMS 对杜仲叶茯砖茶加工过程中的挥发性成分进行检测，对杜仲叶茯砖茶加工过程中挥发性成分的变化规律进行分析，这不仅为杜仲叶茯砖茶品质提升提供了证据，而且对于揭示杜仲叶茯砖茶独特风味和香气的形成机制以及加工过程中香气成分的调控提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杜仲叶茶 略阳县嘉灵特种茶开发中心。

FlavourSpec®风味分析仪 德国G.A.S.公司；MS105 电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；CTC-PAL 自动进样装置 瑞士CTC Analytics AG公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 杜仲叶茶经筛选、渥堆、气蒸、压制成型、发花干燥、陈化等工艺制成，分别于加工过程中的原料筛选、渥堆、气蒸压制成型（即发花第0 d），发花第8、25 d 及陈化1 年等6 个阶段取样，依次编号为EF0、EF1....EF5。所取得茶样迅速破碎混匀，冷冻干燥后，均匀的分为两份，一份密封储藏于4 ℃，用于感官内质评审，另一份密封储存于−80 ℃下待进行GC-IMS 分析。

1.2.2 茶叶感官评审 根据GB/T16291.1-2012《感官分析 选拔、培训与管理评价员一般导则第1 部分：优选评价员》的相关要求，从陕西科技大学食品科学与工程专业招募感官评审人员，经综合评价，筛选出20 人进行茶叶感官培训及考核，最终确定10 人组成茶叶评审小组。按GB/T 23776-2018《茶叶感官审评方法》中关于紧压茶的规定进行感官评审，同时计算各不同样本审评得分，其中，各审评因子的评分系数分别为：外形占20%，汤色占10%，香气占30%，滋味占35%，叶底占5%，茶样审评总得分计算式如下：

式中：Y 为茶叶审评总得分；A～E 分别为外形、汤色、香气、滋味和叶底等品质因子的审评得分；a～e 为各品质因子的评分系数。

1.2.3 顶空进样 精密称取1 g 样品，置于20 mL 顶空瓶中，密封后进样。顶空孵育温度80 ℃，孵育时间15 min，孵化转速500 r/min；进样针温度85 ℃，进样体积500 μL，载气为高纯度 N2（纯度≥99.999 %），不分流模式。

1.2.4 GC-IMS 条件 MXT-5 色谱柱（15 m×0.53 mm×1 μm），色谱柱温60 ℃，分析时间30 min，载气流速初始为2 mL/min，保持2 min；18 min 内线性升至100 mL/min 后保持10 min。

1.3 数据处理

使用仪器配套的分析软件Vocal 查看分析谱图和数据的定性，应用软件内置的NIST 数据库和IMS 数据库可对挥发性物质进行定性分析，运用Reporter 插件对比样品之间的谱图差异，Gallery Plot插件生成挥发性化合物指纹图谱，运用Dynamic PCA 插件进行聚类分析，生成挥发性化合物PCA谱图。

2 结果与分析

2.1 杜仲叶茯砖茶感官评审

对杜仲叶茯砖茶加工过程中所取茶样的外形、汤色、香气、滋味以及叶底等5 个相关因子进行感官审评结果如表1 所示。

由表1 可知，筛选的杜仲叶茶原料呈褐色，少梗，冲泡后有较浓青辛气，汤色黄中带绿，有一定的苦涩味，叶底黄褐并少梗。渥堆过程既包括微生物生长代谢作用，又包括茶叶自身的酶促作用[22]，对茯砖茶品质形成和后续发花的顺利进行有较大影响，杜仲叶茶经过渥堆变得湿润柔软，为后续发花提供了适宜的水分，同时经过渥堆，茶叶色泽加深，茶汤的绿色淡化，苦涩味进一步减弱。经气蒸和压制后初成型的茯砖茶砖面平整，紧度适中，茶砖表面油亮，茶汤色泽、香气和滋味变化大不。发花8 d 后，茶砖表面较干燥，稍显油亮，打开茶砖发现有较茂盛的金花，茶汤呈橙黄色，有明显的菌花香，苦涩味进一步减弱，有一定的醇和口感，叶底颜色由黄色转为棕褐。发花25 d 后，茶砖内部金花普遍茂盛，茶汤呈橙红色，略有青辛气，具有纯正的菌花香和较为圆润、醇和的口感。陈化过程中，茶砖内部金花颜色由金黄转为黄褐色，茶汤颜色进一步由橙红转为棕红，菌花香纯正，无青辛气，无苦味，口感更加的圆润醇和，品质得到了进一步的提升。

表1 杜仲叶茯砖茶感官审评结果Table 1 The result of the organoleptic testing for Eucommia ulmoides leaves Fu brick tea

2.2 杜仲叶茯砖茶加工过程中GC-IMS 二维谱图分析

图1 为杜仲叶茯砖茶加工过程中EF0（原料筛选）、EF1（渥堆）、EF2（气蒸及压制成型，即发花第0 d）、EF3（发花第8 d），EF4（发花第25 d）及EF5（陈化1 年）样品的GC-IMS 二维谱图，图中纵坐标表示气相色谱的保留时间（Retention time, Rt），横坐标表示归一化处理后的漂移时间（Drift time, Dt），而左侧红色垂直线表示反应离子峰（Reaction ion peak, RIP），RIP 峰两侧的每一个点代表一种挥发性成分，白色表示浓度较低，红色表示浓度较高，且点的颜色越深表示浓度越大，该谱图较直观的反映了茯砖茶加工过程中各不同阶段挥发性物质种类及浓度差异[23]。从图1 中可以看出，杜仲叶茯砖茶加工过程中挥发性成分差异明显，和原料相比，杜仲叶茶经渥堆处理后挥发性组分更为丰富，且部分组分含量增大，发花8 d和0 d 相比，部分挥发性组分含量变化较大。和其他阶段样品相比，杜仲叶茯砖茶经过陈化后在谱图上的红点明显增多，说明其挥发性成分越来越丰富[6]。

以EF0 为参照，其他阶段样品所含挥发性成分扣减参照后的对比差异情况如图2 所示，红色代表该物质在该样品中浓度高于EF0，蓝色则代表低于EF0，而浓度相同的物质颜色抵消后呈白色。总体来看，EF1 和EF2 中红色部分明显大于蓝色部分，EF3 中红色部分和蓝色部分相当，EF4 中蓝色部分略大于红色部分，而EF5 中红色部分明显大于蓝色部分。图1 和图2 可共同说明杜仲叶茯砖茶加工过程中挥发性成分有明显的变化。

图1 不同加工阶段杜仲叶茯砖茶的GC-IMS 二维谱图分析Fig.1 GC-IMS two-dimensional map of samples from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fu Brick Tea

图2 不同加工阶段杜仲叶茯砖茶的气相色谱离子迁移谱差异图Fig.2 GC-IMS different two-dimensional map of samples from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fu Brick Tea

2.3 杜仲叶茯砖茶加工过程中GC-IMS 挥发性成分定性分析

图3 中所示的每一个数字代表定性分析出一种挥发性气味物质，整个杜仲叶茯砖茶加工过程中，共检测出70 种挥发性物质，应用软件内置的NIST 数据库和IMS 数据库可对物质进行定性分析发现，可以明确定性的挥发性物质有51 种，包括部分挥发性物质的单体及二聚体，具体见表2。

表2 挥发性组分定性分析Table 2 Qualitative analysis of volatile compounds

续表2

图3 杜仲叶茯砖茶的挥发性成分气相离子迁移谱定性分析Fig.3 GC-IMS qualitative analysis of volatile compounds of Eucommia ulmoides leaves Fu Brick Tea

由表1 可知，明确定性的51 种挥发性物质C 链介于C2～C10，主要包括醛类、酮类、醇类、酯类、吡嗪类、酸类、萜烯类、呋喃类、醚类及含硫化合物等，其中醛类、醇类、酮类、酯类、吡嗪类数量较多。和传统以黑毛茶为原料加工的茯砖茶相比，二者存在一些共有的挥发性成分，包括壬醛、5-甲基糠醛、辛醛、正己醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、丙酮、乙酸乙酯等[6]，这些挥发性成分都具有特殊的香味，如壬醛在低浓度时具有橙子及玫瑰香气，5-甲基糠醛具有甜香、辛香气[6]，辛醛具有醛、蜡香、青果皮香，脂肪和水果香气，正己醛呈青草气味[24]，芳樟醇具有柑橘、铃兰香、花香、青香及木香，1-辛烯-3-醇呈真菌清香、泥土芳香、蔬菜香，乙酸乙酯则具有似醚的气味和微果酒香[6]。同时，杜仲叶茯砖茶和传统以黑毛茶为原料加工的茯砖茶相比[6]，大多数挥发性成分种类不同，说明杜仲叶茯砖茶有其独特的气味特征。

醛类是杜仲叶茯砖茶中鉴定出的数量最多的挥发性成分，共计16 种，从表1 可以看出，醛类物质中的2-已烯醛的单体和二聚体、正己醛的单体和二聚体、壬醛单体和二聚体、葵醛、辛醛和异戊醛等主要赋予了杜仲叶茯砖茶青草香，柑橘香、橙子香等果香及花香[6,24−27]，此外，2-甲基丁醛给予了其焦香和烘焙香[28]，3-甲硫基丙醛赋予了其醇厚的酱香、肉香等，由于醛类的香气阈值较低，因而是影响杜仲叶茯砖茶风味的重要因素。和传统以黑毛茶为原料加工的茯砖茶相比，杜仲叶茯砖茶中具有青草香气和果香花香的醛类物质较多[6]，这可能赋予其更好的风味。杜仲叶茯砖茶中鉴定出的醇类挥发性成分有10 种，主要以蘑菇香、花香、清香、草药香和木香为主，此外，还给予了芝麻、洋葱、大蒜、肉、咖啡香的香气特征以及奶酪香等。杜仲叶茯砖茶中鉴定出的酮类和酯类挥发性成分分别有9 种和5 种，其中酮类以果香、甜香和奶香等为主，而酯类主要是果香和微果酒香，鉴定出的吡嗪类挥发性成分有4 种，主要具有青草味，坚果味以及焦香、烤香，上述挥发性成分构成了杜仲叶茯砖茶特有的气味。

2.4 杜仲叶茯砖茶加工过程中GC-IMS 挥发性气味成分指纹图谱分析

为了进一步更具体直观的表现杜仲叶茯砖茶加工过程中挥发性物质的变化规律，使用Gallery Plot 插件绘制了EF0、EF1、EF2、EF3、EF4 和EF5 的挥发性物质离子迁移指纹谱图，如图4 所示，每个样本3 个平行，图中右侧为样本名称，底部为挥发性物质定性结果，各点颜色深浅代表物质浓度高低，红色代表浓度较高，白色代表浓度较低。

图4 杜仲叶茯砖茶的挥发性成分指纹图谱分析Fig.4 Volatile components fingerprint of samples from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fu Brick Tea

从图4 可以直观看出茯砖茶不同阶段挥发性物质组成具有明显差异，且随着加工过程的进行，杜仲叶茯砖茶中一部分挥发性成分不断减少，另有一部分挥发性成分先增加后减少，还有一部分挥发性成分不断增加。将不同加工阶段的杜仲叶茯砖茶样本指纹图谱分为A、B、C、D、E、F、G 等7 个区域，A 区域的挥发性成分包括康硫醇、2-甲基-3-甲硫基呋喃、环己酮和2-己酮，上述成分主要具有泥土气息，熟菜香和洋葱、大蒜、肉、咖啡香等，在样本中的相对含量总体上随加工过程的进行而逐步减少，其中2-己酮自渥堆阶段起开始逐渐下降，2-甲基-3-甲硫基呋喃、环己酮和康硫醛在发花过程中下降明显。B 区域的挥发性成分是壬醛二聚体、二乙二醇丁醚、2-甲基-3-庚酮、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪单体、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪二聚体、2-乙基-5-甲基吡嗪单体、2-乙基-5-甲基吡嗪二聚体、甲基庚烯酮、芳樟醇和γ-松油烯，上述挥发性成分以焦香、烤香、青草香、橘香和果香为主，且在原料中相对含量较低，而经过渥堆处理后上升明显，这可能是由于渥堆提供的高温高湿环境促进了糖类物质发生脱水、缩合、聚合等焦糖化反应，从而产生焦香[22]，而甜香、果香和花香则可能是由于渥堆过程中微生物的作用。此外，呈青草香、焦香和烤香的吡嗪类物质在进入发花阶段后下降明显，这有助于改善茶叶的风味。C 区域的挥发性成分为辛醛、乙酸、苯甲醛二聚体、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇和丙酸，从图4 中可以看出，这些成分在原料、渥堆和气蒸及压制成型阶段变化较小，而进入发花阶段后，上述挥发性成分明显下降直至发花结束（25 d），该区域的挥发性成分主要以苦杏仁味、烘烤味和醋味为主，其相对含量的下降有助于产品风味的改善。同时，在陈化阶段具有真菌香气的3-甲基-1-戊醇相对含量明显上升，从而增强产品菌香味。D 区域包含的鉴定出的挥发性成分包括2,4-庚二烯醛、1-辛烯-3-醇、叶醇、异丙醇、2-庚酮、异戊醛和乙酸异戊酯，这些成分主要以青香、药香和果香为主，在原料、渥堆和气蒸压制成型样本中含量均较低，但发花促进了上述挥发性成分含量的增加，随着发花时间的延长，2-庚酮、异戊醛和乙酸异戊酯相对含量继续增加，至陈化阶段则开始下降，而其他挥发性成分则在发花8 d后和后续干燥陈化阶段，相对含量开始下降。区域E 中包含的挥发性成分主要有2-庚酮、异戊醛、乙酸异戊酯、3-甲硫基丙醛、2-甲基丁醛和3-呋喃甲醇等，上述挥发性成分以药香、果香和醇厚的酱香为主，在发花的8～25 d 中增加较为明显，这对于形成杜仲叶茯砖茶良好的风味具有重要作用。F 区域中包含的挥发性成分包括3-呋喃甲醇、5-甲基糠醛、二氢-2（3H）-呋喃酮单体、二氢-2（3H）-呋喃酮二聚体、丙烯酸正丁酯单体、丙烯酸正丁酯二聚体、2-已烯醛单体、2-已烯醛二聚体、糠醛单体、糠醛二聚体、2,3-丁二醇等，上述挥发性成分主要具有甜香、辛香、青草香和乳酪香，其中，除具有青草味的2-已烯醛单体相对含量明显下降外，其余成分在杜仲叶茯砖茶陈化阶段的含量均高于其他阶段。区域G 中包括的挥发性成分主要为二甲基二硫单体、二甲基二硫二聚体、正己醛单体、正己醛二聚体、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇和己酸甲酯，上述挥发性成分以果酒香、果香和青草香为主，值得注意的是，此区域中大多数挥发性成分在加工不同阶段相对含量较稳定，包括具有青草香的正己醛单体和二聚体，由于杜仲叶茯砖茶样本中呈青草香气挥发性成分较多，除正己醛和其他阶段相比变化不大外，其他如2-乙基-5-甲基吡嗪单体、2-已烯醛单体随加工过程的进行均明显下降，因此最终杜仲叶茯砖茶中青辛气不明显，这和感官评审结果基本一致。此外，不在上述区域中的呈甜香、花香、橙香和橘香的葵醛、壬醛单聚体在随着加工的进行相对含量逐步上升，促进了杜仲叶茯砖茶良好风味的形成。

从图4 还可以发现，陈化和渥堆阶段红点最多，说明挥发性成分最为丰富，其次为原料和气蒸及压制成型阶段，最后为发花阶段样本，这可能是由于在发花阶段以冠突散囊菌为主的曲霉属为绝对优势菌群，茯砖茶发酵过程中微生物多样性较低[29−30]导致的，尚需进一步证实。此外，和其他加工阶段相比，发花阶段促进了杜仲叶茯砖茶药香、果香和菌香的形成，因此，发花和陈化是促进杜仲叶茯砖茶香气和风味形成的重要步骤。总体来看，所有的70 种挥发性成分在EF5 中的含量较EF0 上升的有37 种，主要为醛类，醇类，酮类和酯类，这些成分具有良好的香气，而下降的成分有33 种，其中下降较为明显的有呈醋酸味的乙酸以及具有青草味，坚果味的2-乙基-5-甲基吡嗪二聚体等，上述成分的含量变化有助于改善杜仲叶茯砖茶成品的香气。不同香气成分之间具有一定的协同作用，如甲苯、乙醇、苯甲醛、2-庚酮、乙酸乙酯、乙酸等风味物质可发生加成或协同作用，从使酒香、果香和花香更强烈[31]，酯类香气物质之间也有较强的协同作用[32]。本实验表明，和EF0 相比，EF5 中苯甲醛二聚体、2-庚酮、乙酸乙酯含量均增加，而且所鉴定出的5 种酯类挥发性成分中有4 种含量增加，这有助于增强各成分之间的协同作用，从而提升杜仲叶茯砖茶的香气品质。此外，渥堆样本中2-乙基-3,5-二甲基吡嗪二聚体，发花8 d 样本中的2,4-庚二烯醛和发花25 d 样本中的3-甲硫基丙醛，以及陈化阶段5-甲基糠醛、丙烯酸正丁酯单体、丙烯酸正丁酯二聚体、糠醛二聚体、2,3-丁二醇等在图4 中各点的颜色明显较其他阶段深，说明其相对含量明显高于上述各成分在其他阶段样本中的含量，这些成分可以分别作为杜仲叶茯砖茶渥堆、发花和陈化阶段的候选标记物进行深入研究。

2.5 基于GC-IMS 的主成分分析

主成分分析可以简化数据并揭示变量间的相互关系，其作为一种多元统计分析技术已广泛应用于食品加工过程中品质差异分析。从图5 可以看出，不同加工阶段杜仲叶茯砖茶挥发性成分PCA 图中PC1 的贡献率为47%，PC2 的贡献率为27%，累计贡献率为74%，表明PC1、PC2 的总贡献率包含了杜仲叶茯砖茶样本的大部分信息，较好的反映了不同茶样之间挥发性成分差异的影响因素。从主成分分析图中可以看出，EF1 和EF2 样本间距离最近，说明渥堆和气蒸压制成型样本之间差异性相对较小，而EF0 和EF1 样本间距离较大，说明渥堆对杜仲叶茯砖茶挥发性成分变化影响较大。发花和陈化阶段样本在PCA 图上和其他样本呈现明显的分离，说明茶样挥发性成分在此过程中发生了很大的变化，发花和陈化对于杜仲叶茯砖茶香气和风味的形成具有重要作用，这与感官审评结果基本一致。

图5 不同加工阶段杜仲叶茯砖茶挥发性成分主成分分析图Fig.5 Principal component analysis plot of samples from different stage during processing of Eucommia ulmoides leaves Fu Brick Tea

3 结论

采用 GC-IMS 技术分析了杜仲叶茯砖茶加工过程中挥发性成分，共检测出70 种挥发性成分，其中明确定性的有51 种，包括醛类、酮类、醇类、酯类、吡嗪类、酸类、萜烯类、呋喃类、醚类及含硫化合物等。通过构建杜仲叶茯砖茶GC-IMS 挥发性成分指纹图谱和PCA 分析，可明确各不同阶段杜仲叶茯砖茶特征风味物质，发花和陈化对于形成杜仲叶茯砖茶香气和风味特征具有重要作用，最终形成了杜仲叶茯砖茶较好的药香、果香和菌香。考虑到各不同挥发性成分在赋予茯砖茶良好风味和香气时的互补和协调作用，因此，除GC-IMS 外，还可以采用GC-MS、电子鼻、气相色谱-嗅觉-质谱测定法（GC－O－MS）等多种仪器分析和感官评审结合起来进行研究将有助于更准确的评价其风味和品质[33−35]。2-乙基-3,5-二甲基吡嗪二聚体、2,4-庚二烯醛、3-甲硫基丙醛、5-甲基糠醛、丙烯酸正丁酯单体、丙烯酸正丁酯二聚体、糠醛二聚体、2,3-丁二醇等挥发性成分分别在杜仲叶茯砖茶加工特定阶段的相对含量远高于其他阶段，可以作为杜仲叶茯砖茶渥堆、发花和陈化阶段的候选标记物，后续应进一步对此进行深入研究，从而为杜仲叶茯砖茶的加工水平的提升、风味鉴别和品质评价等提供依据和参考。