自然青贮多花黑麦草优良乳酸菌的筛选及对多花黑麦草青贮品质的影响

袁洁，马冉冉，张文洁，许能祥，赵冉冉，顾洪如，丁成龙*

（1. 江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京210014；2. 江苏省农业科学院农业资源与环境研究所，江苏 南京210014；3. 农业农村部种养结合重点实验室，江苏 南京210014）

多花黑麦草（Lolium multiflorum）为禾本科黑麦草属植物，具有生长快、产量高、营养丰富、质地柔软、畜禽喜食等特点，以鲜草、青贮、干草形式来饲喂反刍动物，是我国重要的饲料作物之一［1−3］。多花黑麦草常作为牧草在我国南方冬闲田种植，其生产具有鲜明的季节性，产草集中于翌年高温多雨的4−5 月，满足家畜饲喂之后仍然有大量青饲料剩余，加工贮存非常重要［4−5］。高温多雨的天气导致干草调制较为困难，可操作性不强［6−7］。青贮调制受降水等天气因素的影响较小，能够保存饲草营养成分，同时可以提升饲草的适口性和营养价值，是保存多花黑麦草较为理想的方式，同时可以解决全年家畜青饲料分配不均的问题［8］。

在实际生产中，多花黑麦草直接青贮难度较大，难以得到优质的青贮饲料。一是因为多花黑麦草含水量较高，极易导致梭状芽孢杆菌的大量繁殖，使得丁酸积累，引起蛋白分解、产生大量氨态氮，青贮品质恶化［3，7］。二是因为新鲜牧草表面附着的有害微生物远远多于乳酸菌，且附着乳酸菌多为异型发酵乳酸菌，因而自然青贮时同型发酵乳酸菌难以成为优势菌群，青贮发酵途径难以控制，青贮发酵品质不稳定，青贮发酵极易失败［9−11］。外源添加乳酸菌能够确保青贮尽快进入乳酸菌主导的发酵阶段，降低多花黑麦草青贮料的pH 和氨态氮含量，增加乳酸菌含量，提升青贮发酵品质［5，12−15］。青贮发酵过程中的乳酸菌必须生长快速且具备较强的产酸能力，才能快速降低青贮料的pH，防止腐败微生物的发酵，减少营养损失，从而制备优质的青贮饲草［16］。因此，添加生长快速、产酸能力强的乳酸菌菌株，是研发优良乳酸菌菌剂的核心，对于制备优良青贮多花黑麦草具有重要意义。

多花黑麦草青贮调制相关研究中涉及的乳酸菌主要有市售乳酸菌制剂［12］、植物乳杆菌［5，13］、短乳杆菌［14］、鼠李糖乳杆菌［15］、布氏乳杆菌［15］等。张静等［12］研究表明，市售乳酸菌制剂能够显著提高青贮多花黑麦草乳酸含量，对乙酸含量、氨态氮/总氮、可溶性碳水化合物含量以及干物质含量均无显著影响。李君临等［5］的研究表明，植物乳酸菌能够显著提高多花黑麦草的青贮发酵品质，但是对干物质含量、可溶性碳水化合物、酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量均无显著影响。Parvin 等［14］研究表明，植物乳杆菌能显著提高多花黑麦草青贮发酵品质，但是其对酵母数量没有显著影响，同时显著抑制了乳酸菌的繁殖。尽管短乳杆菌抑制了酵母的繁殖，但是其对发酵品质的改善效果远低于植物乳杆菌［14］。Li 等［15］研究表明，市售鼠李糖乳杆菌能显著提高多花黑麦草青贮发酵品质，但是其对干物质含量没有显著影响。尽管市售布氏乳杆菌抑制了酵母菌的繁殖，但是其对发酵品质的改善效果远低于鼠李糖乳杆菌［14］。为了获得更好的青贮饲料，研究和评价适用于饲草青贮发酵过程的新菌株非常有必要［17］。目前，尚缺少关于多花黑麦草青贮料中优良乳酸菌筛选及应用的研究。

本试验筛选自然青贮多花黑麦草中的优良乳酸菌菌株，分析菌株生理生化活性及其对多花黑麦草青贮品质的影响，以期筛选出适用于多花黑麦草青贮发酵的乳酸菌菌株，为多花黑麦草青贮乳酸菌菌剂的研发提供菌株和理论依据。

1 材料与方法

1. 1 乳酸菌的分离和优良菌株的筛选

供试多花黑麦草为四倍体多花黑麦草品种“TETILA”，由百绿公司提供，种植于江苏省农业科学院溧水种植基地，在抽穗期（2019 年4 月20 日）进行刈割，刈割后凋萎1. 5 h，使其含水量下降至70%［3］，铡刀切至2～3 cm，手工混合均匀，称取300 g 装入40 cm×30 cm 的聚乙烯袋内，真空封口机封口，室温避光发酵60 d 后开袋取样，用于分离乳酸菌。

称取20 g 青贮多花黑麦草，置于含180 mL 无菌生理盐水的密封三角瓶内，120 r·min−1室温振荡1 h，单层无菌纱布过滤，获得10−1梯度滤液，进行梯度稀释。 选取10−5、10−6、10−73 个梯度，各取稀释液100 μL，涂布于deMan，Rogosa，and Sharpe（MRS）固体培养基，于37 ℃倒置培养48 h 进行乳酸菌的分离。对分离的菌株在MRS 固体培养基上纯化2 次，进行革兰氏染色、菌体形态观察、过氧化氢酶接触试验［18］，革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性的菌株为乳酸菌，进行甘油保藏。

将分离纯化的乳酸菌活化，按1% 的接种量加入5 mL MRS 液体培养基中，37 ℃静置培养24 h，利用Bio-Tck微孔板分光光度计（Eon，美国）测定菌液OD600nm，用Mettler Toledo 型pH 计（FE20，中国）直接测定发酵上清液pH，初步筛选生长速率快、产酸能力强的乳酸菌。

1. 2 乳酸菌菌株生理生化特征分析

参照《乳酸菌科学与技术》［18］，进行初筛乳酸菌菌株的代谢葡萄糖产气试验，鉴定乳酸菌的发酵类型，不产气的为同型发酵乳酸菌，产气的为异型发酵乳酸菌。将初筛的乳酸菌活化，活化菌株按1% 的接种量接种到MRS液体培养基中，分别在5、15、25、35、45 ℃中静置培养24 h，测定菌液OD600nm，比较菌株在不同温度下的生长情况；活化菌株按1% 的接种量分别接种至pH 为7. 0、6. 5、6. 0、5. 5、5. 0、4. 5、4. 0、3. 5、3. 0 和2. 5 的MRS 液体培养基中，37 ℃静置培养24 h，测定菌液OD600nm，分析乳酸菌的耐酸性。活化菌株按1% 的接种量分别接种至NaCl 浓度为3. 0%、6. 5%、10. 0%、20. 0%（w/v）的MRS 液体培养基中，37 ℃培养24 h 后，测定菌液OD600nm，分析乳酸菌的耐盐性［10］。

1. 3 乳酸菌菌株的16S rRNA 序列分析及系统发育树的构建

提取初筛菌株的基因组DNA，采用原核生物16S rRNA 通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR 扩增［10］，扩增产物送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。将测得的16S rRNA 序列提交NCBI Genbank（http：//blast. Ncbi. nlm. nih. gov/Blast）进行Blast 同源性比对分析，得出菌株的属种信息。选取Genbank 中与初筛菌株相似度最高的已知菌株序列，利用MEGA 5. 1 软件采用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，对乳酸菌的系统发生地位进行分析，Bootstrap（1000 次重复）检验各分支的置信值。

1. 4 乳酸菌菌株生长曲线和产酸性能测定

将初筛的乳酸菌活化，活化菌株按1% 的接种量接种到MRS 液体培养基，混合均匀测定发酵液OD600nm初始值和pH 初始值，37 ℃静置培养，在32 h 内每隔2 h 混合菌液并测定OD600nm和pH。以菌株的培养时间为横坐标，以OD600nm和pH 为纵坐标，分别绘制生长曲线图和产酸性能图［10］。取36 h 发酵液，经0. 22 μm 水相滤膜过滤，利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测条件分析滤液中有机酸的种类和含量。

1. 5 多花黑麦草青贮调制、青贮品质及微生物数量分析

在抽穗期（2020 年4 月24 日）刈割多花黑麦草，刈割后凋萎1. 5 h，使其含水量下降至约70%，铡刀切至2～3 cm，手工混合均匀［3，6］。多花黑麦草原料营养成分和微生物数量见表1。

表1 多花黑麦草原料营养成分和微生物数量Table 1 Chemical and microbial population in the material of Italian ryegrass

在多花黑麦草中分别添加不同的乳酸菌菌剂，按照1. 0×106cfu·g−1的添加比例［10］，用喷壶均匀喷洒于切碎的多花黑麦草上，对照组添加相应体积的水（30 mL）。 称取300 g 装入40 cm×30 cm 的聚乙烯袋内，真空封口机封口。每个处理调制3 个重复，室温避光发酵60 d 后开袋取样，进行青贮营养品质分析、发酵品质分析以及青贮微生物计数。

取150 g 多花黑麦草原料或青贮样品，105 ℃杀青30 min，65 ℃烘干至恒重，测定干物质（dry matter，DM）含量［12］。 样品粉碎后过0. 38 mm 筛子，采用FOSS 8400 型全自动凯氏定氮仪（丹麦）蒸馏测定粗蛋白（crude protein，CP）含量［19］。采用蒽酮−硫酸比色法测定可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）和淀粉（starch）含量［20］。 采用范氏洗涤纤维法测定中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）和酸性洗涤木质素（acid detergent lignin，ADL）含量，计算获得纤维素（cellulose）和半纤维素（hemicellulose）含量［21］。

取20 g 多花黑麦草或其青贮样品，置于三角瓶内，加入180 mL 的蒸馏水，充分混匀后于4 ℃静置24 h，4 层纱布过滤后，获得滤液，使用Mettler Toledo 型pH 计（FE20，中国）测定滤液pH 值［22］。滤液经0. 22 μm水相滤膜过滤后，根据Liu 等［22］的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测条件分析滤液中乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）、丁酸（butyric acid，BA）、异丁酸（isobutyric acid，ISOBA）含量。利用苯酚−次氯酸钠比色法测定滤液中氨态氮（NH3-N）含量［23］。

取10 g 多花黑麦草或其青贮样品，置于含90 mL 无菌生理盐水（0. 9%）的密封三角瓶内，120 r·min−1室温振荡1 h，单层无菌纱布过滤，获得10−1梯度滤液，进行梯度稀释，获得10−2、10−3、10−4、10−5、10−6、10−7梯度稀释液［24］。采用平板计数法进行好氧细菌、乳酸菌、酵母、霉菌计数。取不同梯度的稀释液各100 μL，分别涂布于营养琼脂培养基、MRS 琼脂培养基、孟加拉红琼脂培养基中［22］。营养琼脂培养基在37 ℃培养1 d 后进行好氧细菌计数，MRS 琼脂培养基在37 ℃培养2 d 后进行乳酸菌计数，孟加拉红培养基在28 ℃培养1 d 后进行酵母菌计数、培养3 d 后进行霉菌计数。

1. 6 数据统计与分析

采用SPSS 13. 0（IBM，芝加哥，美国）软件进行数据统计与分析。利用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey’s 检验（P<0. 05）对两组以上数据进行统计与分析。利用Origin 8. 6 和Photoshop CS6 进行图像处理。

2 结果与分析

2. 1 多花黑麦草青贮乳酸菌分离和初筛

本试验共分离获得180 株乳酸菌，编号为PR_LAB_1～PR_LAB_180。如图1 所示，180 株乳酸菌培养24 h 后，OD600nm为0. 61～1. 68，发酵液的pH 为3. 85～4. 61，其中OD600nm≥1 且pH<4 的乳酸菌有5 株，为菌株PR_LAB_9、PR_LAB_34、PR_LAB_67、PR_LAB_76 和PR_LAB_86，为初筛获得的优良乳酸菌菌株。

图1 180 株乳酸菌在MRS 培养液中培养24 h 的菌液OD600nm及pHFig. 1 The OD600nm and pH value of 180 strains of lactic acid bacteria cultured in MRS medium for 24 h

2. 2 青贮乳酸菌的形态及生理生化特性

如表2 所示，5 株菌均为革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性，其中PR_LAB_76 为球菌，其他4 株均为杆菌。5 株乳酸菌在葡萄糖发酵产气试验中不产气，为同型发酵乳酸菌。5 株乳酸菌均能够在NaCl 浓度为3. 0%，15～35 ℃，以及pH 为3. 5～7. 0 的MRS 液体培养基中良好生长（＋＋＋）；在NaCl 浓度为6. 5%，以及pH 为3. 0 的MRS 培养基中一般生长（＋＋）；在NaCl 浓度为10. 0%，以及5 和45 ℃的MRS 培养基中微弱生长（＋）；在NaCl 浓度为20. 0%，以及pH 为2. 5 的MRS 液体培养基中不能生长（−）。

表2 乳酸菌的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria

2. 3 乳酸菌16S rRNA 鉴定

将测序结果提交NCBI 进行Blast 比对分析，结果表明，5 株乳酸菌的序列与数据库中已知的16S rRNA基因序列的相似性均高于99. 00%（表3）。 其中，PR_LAB_9 的序列与植物乳杆菌最为接近，为99. 93%；PR_LAB_34、PR_LAB_67、PR_LAB_86 与植物乳杆菌的相似度为100. 00%。由系统发育树可知，PR_LAB_9、PR_LAB_34、PR_LAB_67、PR_LAB_86 与植物乳杆菌亲缘关系最为接近（图2）。 PR_LAB_76 与戊糖片球菌的相似度为99. 86%，与戊糖片球菌在系统发育树中亲缘关系最为接近（图2）。

表3 基于16S rRNA 序列的NCBI 比对结果Table 3 NCBI alignment results based on 16S rRNA sequence

图2 多花黑麦草青贮乳酸菌16S rRNA 系统发育树Fig. 2 Phylogenetic dendrogram of lactic acid bacteria from natural silage L. multiflorum based on the 16S rRNA fragments

2. 4 乳酸菌菌株生长性能和产酸能力测定

2. 4. 1 乳酸菌菌株生长性能测定 由图3A 可知，5 株乳酸菌能够在2～4 h 开始快速生长，在4～12 h 生长速率达到最大，大约12 h 生长速度变缓，进入稳定期，随后菌液OD600nm变化较小，在32 h 没有出现菌体生长衰退。菌株PR_LAB_9、PR_LAB_34、PR_LAB_67、PR_LAB_76 和PR_LAB_86 发酵12 h 的菌液OD600nm分别为1. 508、1. 446、1. 517、1. 595 和1. 589。 在24 h 内，生长速度最快的是菌株PR_LAB_76，其次是菌株PR_LAB_86、PR_LAB_9 和PR_LAB_67，生长速度最慢的是PR_LAB_34。

图3 乳酸菌生长曲线（A）和产酸性能（B）、24 h 产乳酸量（C）和24 h 产乙酸量（D）Fig. 3 Growth curve（A），acid production capacity（B），lactic acid production at 24 h（C），and acetic acid production at 24 h（D）of lactic acid bacteria

2. 4. 2 乳酸菌菌株产酸能力测定 如图3B 所示，5 株乳酸菌在2～8 h 的产酸速率较快，8～12 h 产酸速率逐渐下降，14～32 h 产酸速率保持平稳，最终pH 保持在3. 8 左右。 菌株PR_LAB_9、PR_LAB_34、PR_LAB_67、PR_LAB_76、PR_LAB_86 发酵12 h 之后的pH 值分别为4. 09、4. 12、4. 07、4. 06 和4. 07。 在24 h 内，菌株PR_LAB_76 的产酸速率快于其他菌株。进一步通过HPLC 测定5 株乳酸菌发酵液中乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸含量，分析不同乳酸菌的产酸种类和含量产能力。如图3C，D 所示，5 株乳酸菌主要产生乳酸和乙酸，发酵24 h 之后的乳酸含量分别为133. 20、132. 65、134. 66、136. 73 和135. 13 mmol·L−1，发酵24 h 之后的乙酸含量分别为57. 51、55. 77、56. 54、58. 86 和56. 08 mmol·L−1。在24 h 内，菌株PR_LAB_76 的产乳酸和乙酸的量高于其他4株乳酸菌。

2. 5 乳酸菌接种后多花黑麦草青贮发酵品质、微生物数量和营养品质分析

2. 5. 1 乳酸菌接种后多花黑麦草青贮发酵品质分析 与对照组相比，乳酸菌接种可显著（P<0. 05）降低多花黑麦草青贮料的pH 值、氨态氮和异丁酸含量，同时显著（P<0. 05）提高了青贮料的乳酸、乙酸含量和乳酸/乙酸（表4）。其中，菌株PR_LAB_76 处理组多花黑麦草青贮料的pH 低于其他4 株乳酸菌处理组，乳酸含量高于其他4 株乳酸菌处理（表4）。

2. 5. 2 乳酸菌接种后多花黑麦草青贮微生物数量分析 与对照组相比，5 株乳酸菌可显著（P<0. 05）降低多花黑麦草青贮料的好氧细菌数量和酵母数量，显著（P<0. 05）提高青贮料的乳酸菌数量（表5）。 其中，菌株PR_LAB_76 处理组多花黑麦草青贮料的乳酸菌数量高于其他4 株乳酸菌处理组，酵母数量低于其他4 株乳酸菌处理组（表5）。

表5 乳酸菌对多花黑麦草青贮微生物数量的影响Table 5 Effects of lactic acid bacteria on microbial counts in Italian ryegrass silage（Log10 cfu·g-1 FM）

2. 5. 3 乳酸菌接种后多花黑麦草青贮营养品质分析 与对照组相比，5 株乳酸菌可显著（P<0. 05）提高多花黑麦草青贮料的可溶性碳水化合物含量；PR_LAB_67、PR_LAB_76 和PR_LAB_86 可显著（P<0. 05）降低青贮料的中性洗涤纤维含量；PR_LAB_76 和PR_LAB_86 可显著（P<0. 05）降低青贮料的酸性洗涤纤维和纤维素含量；PR_LAB_76 可显著（P<0. 05）降低青贮料的干物质损失，显著（P<0. 05）提高青贮料的干物质含量和粗蛋白含量（表6）。

表6 乳酸菌对多花黑麦草青贮营养品质的影响Table 6 Effects of lactic acid bacteria on nutritional quality in Italian ryegrass silage

综合考虑，PR_LAB_76 处理组多花黑麦草的青贮品质最优（表4～6），其干物质、粗蛋白、可溶性碳水化合物、乳酸含量最高，pH 值最低，乳酸菌数量最多，酵母菌数量最少。

表4 乳酸菌对多花黑麦草青贮发酵品质的影响Table 4 Effects of lactic acid bacteria on fermentation quality in Italian ryegrass silage

3 讨论

3. 1 多花黑麦草青贮乳酸菌的筛选和鉴定

乳酸菌的生长速率和产酸能力直接影响青贮饲草的品质，是优质乳酸菌评价的重要指标［16］。乳酸菌生长速率快，可以使得青贮料中的乳酸菌数量快速增多，促进发酵。乳酸菌产酸速度及产酸能力快，可以使得发酵青贮料的pH 快速降低，减少饲草营养损失。布氏乳杆菌、干酪乳杆菌和植物乳杆菌是强化青贮过程的常用乳酸菌［15，22，25］。李小铃等［10］从狼尾草属（Pennisetum）牧草中分离出生长速率高且产酸效率强的植物乳杆菌3 株和戊糖片球菌1 株。张红梅［26］分离的1 株编号为31 的优良植物乳杆菌在培养12，24，36 和48 h 时OD600nm分别大于0. 3，0. 6，0. 8 和1. 0，该菌株有效提高了垂穗披碱草（Elymus nutans）的青贮品质。本试验以青贮多花黑麦草为材料，分离纯化180 株乳酸菌，以生长速率和产酸效率进行初筛，获得5 株优良菌株（图1），均能够在12 h 内快速繁殖和产酸（图3），经鉴定，PR_LAB_9、PR_LAB_34、PR_LAB_67、PR_LAB_86 为植物乳杆菌，PR_LAB_76 为戊糖片球菌（表3，图2）。饲草青贮发酵是青贮微生物系统中微生物种群增殖变化和群落演替的过程，不同温度、酸碱度、盐度等均会影响乳酸菌的生长［10］。本试验分离的5 株乳酸菌均能在NaCl 浓度为3. 0% 和6. 5%，10～40 ℃，pH 为3. 5～8. 0 的MRS 液体培养基中良好生长，在pH 为3. 0 以及45 ℃环境条件下生长较弱（表2）。因而，本试验分离的5 株乳酸菌对盐、温度、酸碱度均有一定范围的适应性，具有良好的青贮潜能。

3. 2 乳酸菌对多花黑麦草青贮微生物数量、发酵品质和营养品质的影响

饲草表面附着微生物影响青贮发酵最终品质，当其附着乳酸菌数量不足，乳酸菌无法成为优势菌群，从而导致青贮发酵效果不理想，青贮发酵品质和营养品质降低［10，27］。本试验中青贮前多花黑麦草自然附着乳酸菌数量（<105cfu·g−1FM）较少，而好氧细菌数量（>106cfu·g−1FM）、霉菌数量（>103cfu·g−1FM）和酵母菌数量（>103cfu·g−1FM）较多（表5），自然青贮后的发酵品质（pH>4. 2）（表4）、营养品质不佳（表6）。乳酸菌是青贮厌氧阶段的主要微生物，将饲草的可溶性碳水化合物转化为乳酸、乙酸等有机酸，随之降低青贮发酵体系的pH，抑制有害微生物的繁殖，延长青贮料贮存期，并且能够改善青贮料发酵品质［28−32］。成功的青贮意味着乳酸菌取代了饲草最初的附着微生物［33］。接种乳酸菌添加剂能够增加青贮料中乳酸菌的数量，减少青贮料中好氧细菌和酵母的数量［34］。并且，接种乳酸菌能够提高青贮料乳酸含量，显著降低pH 值，降低青贮料的干物质损失［35］。研究表明，接种植物乳杆菌能够提高多花黑麦草青贮发酵品质，但是其对酵母数量没有显著影响，同时显著抑制了乳酸菌的繁殖［14］。尽管接种短乳杆菌抑制了酵母的繁殖，但是其对发酵品质的改善效果远低于植物乳杆菌［14］。接种本试验分离的5 株乳酸菌后，多花黑麦草青贮料的乳酸菌数目增加且达到优质青贮的标准，好氧细菌和酵母的数量显著降低（表5），并且青贮料的乳酸和乙酸含量显著增加、pH 值显著降低（表4），表明该5 株乳酸菌均能够有效改善青贮微生物群落组成，促进多花黑麦草青贮发酵。

氨态氮的含量反映了青贮过程中粗蛋白的降解情况，是评价青贮过程的一个重要参数。普遍认为，在pH 值较低时，饲草的蛋白水解活性会降低。研究表明，尽管市售乳酸菌制剂能够显著提高青贮多花黑麦草乳酸含量，但是其对乙酸含量和氨态氮含量均无显著影响［12］。在本研究中，与对照相比，所有乳酸菌处理组的氨态氮含量显著降低，这可能与乳酸菌接种后pH 值迅速降低有关（表4），抑制了梭状芽孢杆菌等微生物的生长和蛋白水解活性［36］。可溶性碳水化合物残留量越高，说明青贮发酵过程中干物质损失越小，从而产生营养价值更高的青贮饲料［37］。研究表明，市售乳酸菌制剂［12］和植物乳杆菌［5］对青贮多花黑麦草的可溶性碳水化合物含量和干物质含量均无显著影响［12］。本试验分离的5 株乳酸菌均可显著增加青贮多花黑麦草的可溶性碳水化合物残留量（表6），这是因为乳酸菌接种引起青贮料中快速的乳酸发酵和pH 值的快速降低，从而抑制了不良细菌发酵的可溶性碳水化合物的损失。因此，本试验分离的5 株乳酸菌可用于提高青贮多花黑麦草发酵品质和营养品质（表4 和表6）。其中，戊糖片球菌PR_LAB_76 处理的多花黑麦草青贮料的品质最优（表4～6）。对于这种现象可能的解释是：戊糖片球菌PR_LAB_76 的生长和产酸速度快于其他4 株植物乳杆菌（图3）。

3. 3 戊糖片球菌作为青贮添加剂的优势

商用的乳酸菌制剂通常含有植物乳杆菌、干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌，部分含有戊糖片球菌、嗜酸片球菌和屎肠球菌［14］。研究表明，市售乳酸菌制剂［12］、植物乳杆菌［5，13］、短乳杆菌［14］、鼠李糖乳杆菌［15］、布氏乳杆菌［15］均能够提高青贮多花黑麦草青贮发酵品质，但是对营养品质并没有明显的改善效果。本研究中，戊糖片球菌PR_LAB_76 接种后，青贮多花黑麦草发酵品质显著提高，干物质、粗蛋白、可溶性碳水化合物含量均显著增加，并且中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、纤维素含量显著降低（表4～6）。因此，本试验中的戊糖片球菌PR_LAB_76 更适用于多花黑麦草的青贮调制。李东霞等［38］从自然青贮苜蓿（Medicago sativa）中筛选获得一株戊糖片球菌a144，其能够快速降低青贮苜蓿pH，显著提升青贮苜蓿发酵品质和营养品质。张红梅等［39］发现戊糖片球菌和植物乳杆菌混合添加剂接种后，青贮垂穗披碱草中乳酸菌数量显著增加，氨态氮和中性洗涤纤维含量显著降低，粗蛋白含量显著增加。一般认为，片球菌、肠球菌、乳球菌和明串珠菌是青贮初期发酵的发酵剂，随后被更能够耐受酸度的植物乳杆菌和短乳杆菌所取代［14］。因此推测，戊糖片球菌在饲草青贮调制中能够迅速降低pH，抑制腐败微生物的繁殖，减少粗蛋白和可溶性碳水化合物的损失，从而使得青贮饲草能够保存更多的营养物质、减少干物质损失。同时，快速降低的pH 有利于更耐酸的乳酸菌繁殖，进一步增强了饲草的青贮发酵。

4 结论

本研究从多花黑麦草青贮料中分离筛选获得5 株乳酸菌菌株，PR_LAB_9、PR_LAB_34、PR_LAB_67、PR_LAB_86 为植物乳杆菌，PR_LAB_76 为戊糖片球菌。5 株乳酸菌接种剂在降低多花黑麦草青贮料pH 值和氨态氮含量的同时，增强了可溶性碳水化合物的保存。其中，戊糖片球菌PR_LAB_76 处理的多花黑麦草青贮料的品质最优，其干物质、粗蛋白、可溶性碳水化合物、乳酸含量最高，pH 值最低，乳酸菌数量最多，酵母菌数量最少。本试验为调制优质多花黑麦草青贮饲料提供了菌株。