瑞舒伐他汀对晚期糖基化终产物修饰的低密度脂蛋白诱导肥大细胞活化的影响及其机制

赵馨娜，刘学波，吴宗贵

糖尿病是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的独立危险因素，具有极强的致血管病变作用。糖尿病患者不仅冠心病的发病率是非糖尿病患者的数倍，且其冠状动脉病变常累及多支、全壁，病变血管狭窄程度重，病变处斑块极不稳定，容易破裂，可导致急性冠状动脉综合征,甚至猝死，具有较高的致死率、致残率。因此，研究糖尿病中诱发动脉粥样硬化斑块破裂的因素对糖尿病合并冠心病的防治具有重大意义。

近年来，糖尿病导致动脉粥样硬化的相关分子机制研究取得了重大进展，其中，LDL经糖基化修饰后所形成的晚期糖基化修饰低密度脂蛋白(advanced glycation end product modified low density lipoprotein， AGE-LDL)，对动脉粥样硬化的发生和发展起到了非常关键的作用。研究表明，糖尿病患者体内的AGE-LDL水平远高于非糖尿病患者，且其水平与心血管疾病的罹患风险呈正相关[1]。而大量定植于血管周围及外膜的肥大细胞在诱发动脉粥样硬化斑块失稳定致突发破裂中亦扮演重要角色，其功能的发挥主要通过活化及脱颗粒来实现。肥大细胞活化及脱颗粒产物包括组胺、蛋白酶及多种炎性因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、IL-8和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)等，可诱发血管痉挛，降解基质削弱纤维帽、促进内皮细胞凋亡、诱导血管新生增加斑块内出血及调节巨噬细胞胆固醇逆转运等[2]，增加斑块不稳定性。他汀类药物是3羟基-3甲基-戊二酰—辅酶 A (HMG-CoA) 还原酶抑制剂，除降脂外，更具有直接的免疫调节和抗炎作用[3]，从而成为临床动脉粥样硬化治疗中的常用药物。近期研究表明，他汀类药物能够介导肥大细胞凋亡[4]。瑞舒伐他汀是目前指南推荐的高强度他汀类药物之一，其对肥大细胞活性影响尚未见报道。本研究主要观察瑞舒伐他汀对AGE-LDL激活肥大细胞的影响，并探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：6～8周龄的雄性C57/BL6小鼠，购于中国人民解放军海军军医大学动物实验中心，合格证号：SYXK(沪)2017-0004。

1.1.2 实验试剂：RPMI1640培养基(美国Hyclone公司)，FBS(美国GIBCO公司)，小鼠 IL-6、TNF-α、MMP-9ELISA检测试剂盒(北京达科为有限公司)，双抗(青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml，美国MP公司)，重组小鼠IL-3(rmIL-3)和重组小鼠干细胞因子(SCF，PeproTech公司)，PBS、FITC标记的抗小鼠 CD117(c-Kit)单克隆抗体和PE标记的抗小鼠FcεRIα单克隆抗体 (Biolegend公司)，流式缓冲液 (Miltenyi Biotec公司)，BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司)，瑞舒伐他汀药物原粉(阿斯利康公司)，PrimeScriptRRT Master Mix试剂盒、SYBRRPremix Ex TaqTM试剂盒[Takara，宝生物工程(大连)有限公司]。抗β-Actin兔多克隆抗体(北京康为世纪生物科技有限公司)，磷酸化p65(p-p65)、丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)磷酸化p38(p-p38)、 MAPK磷酸化细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2(p-ERK1/2)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)兔单克隆抗体(Signaling Tecnology公司)，抗GAPDH鼠单克隆抗体(上海康成生物工程有限公司)。ECL化学发光液、Western预染蛋白 Marker、蛋白酶及磷酸酶抑制剂 Cocktail(Thermo公司)。RIPA(蛋白提取液)及PMSF(上海申能博彩生物技术有限公司)，Western抗体稀释液(天恩泽生物技术有限公司)。

1.2 实验方法 2019年6月—2020年12月于海军军医大学中心实验室进行。

1.2.1 小鼠骨髓来源肥大细胞(mBMMCs)的分离、培养：将6～8周龄的雄性C57/BL6小鼠处死，无菌条件下冲洗小鼠长骨骨髓腔。收集冲得的骨髓细胞，调整细胞密度为(0.5～1.0)×106/ml，加入RPMI 1640培养基(含50 μmol/L β-巯基乙醇、20 ng/ml rmIL-3，40 ng/ml rmSCF，10%FBS和双抗)，置于37℃孵箱中培养。每3 d将悬浮细胞转移至新的培养体系中继续培养。培养4～6周后收集悬浮细胞，对形态和功能进行鉴定[5]。鉴定mBMMCs表面标记CD117和FcεRIα双阳性表达率为95%以上。

1.2.2 AGE-LDL的制备：参照参考文献[6]方法，用含EDTA和蔗糖的高糖反应液在37℃下与LDL共同孵育2周，以不含糖的反应液在相同条件下孵育LDL(n-LDL)作为对照。2周后在4℃下用无菌PBS充分透析，荧光检测LDL糖化程度。经0.22 μm无菌滤器在超净台内过滤后加入保存液，分装后于-80℃长期保存备用。

1.2.3 mBMMCs分泌功能实验及分组：mBMMCs同步化后，以5×105/ml浓度种于6孔板中，分别加入PBS(Control组)、不同浓度的AGE-LDL(0.5 μg/ml、5 μg/ml、50 μg/ml,AGE-LDL组)、n-LDL 50 μg/ml(n-LDL组，阴性对照组)、LPS 100 ng/ml(LPS组,阳性对照组)、不同浓度的瑞舒伐他汀(1 mmol/L、10 mmol/L、50 mmol/L)预孵24 h后+AGE-LDL 50 μg/ml(瑞舒伐他汀+AGE-LDL组)，干预刺激6 h后收集细胞，留待抽提RNA，24 h后收集上清留待ELISA检测TNF-α、IL-6和MMP-9含量。相同实验方案重复4次，每个样品设3个复孔，取其平均值。

1.2.4 Real-time PCR(RT-PCR)检测炎性因子基因表达：用Trizol试剂抽提总RNA，参照TakaraPrimeScriptRRT Master Mix试剂说明制备cDNA。依照Takara SYBRRPremix Ex TaqTM试剂盒说明书进行RT-PCR反应，反应体系为25 μl，所用引物如下：TNF-α上游：5'- CTCCAGCTGGAAGACTCCTCCCAG-3',下游：5'- CCCGACTACGTGCTCCTCACC-3'；IL-6上游: 5'- TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG-3'，下游: 5'- TCTGACCCACAGTGAGGAATGTCCAC-3'；MMP-9上游：5'-TCTTCCCCAAAGACCTGAAAA-3'，下游：5'-TTTGGAATCGACCCACGTCT-3’；内参基因β-actin上游：5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'，下游：5'- CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3。反应条件为95℃ 30 s,95℃ 5 s、60℃ 30 s、72℃ 15 s重复40个循环，最后95℃ 15 s,60℃ 15 s,95℃ 15 s。每个反应重复4次。以2-△△CT相对定量法计算目的基因表达。

1.2.5 ELISA检测上清内TNF-α、IL-6、MMP-9蛋白水平：严格按照相应ELISA试剂盒说明书操作步骤进行。

1.2.6 Western-blot检测MAPK、NF-κB信号通路表达及分组：mBMMCs同步化后，以5×105/ml浓度种于6孔板中，分别加入PBS(Control组)、AGE-LDL 50 μg/ml (AGE-LDL组)、n-LDL 50 μg/ml(n-LDL组)、瑞舒伐他汀10 mmol/L + AGE-LDL 50 μg/ml(瑞舒伐他汀+AGE-LDL组)，干预刺激30 min后收集细胞。同步化后的mBMMCs再分别与MAPK p38、ERK1/2及NF-κB抑制剂SB203580(10 mmol/L)、PD98059(20 mmol/L)及PDTC(20 mmol/L)预孵2 h，加入 AGE-LDL(50 μg/ml)，作用1 h后收集细胞。用冷PBS洗涤细胞2次，使用200 μl含抑制剂的预冷RIPA裂解液冰上裂解细胞30 min，4 ℃ 16 000 g离心30 min后收集上清。用SDS-PAGE电泳分离蛋白，转至PVDF膜上。按说明书推荐浓度稀释一抗和二抗，先后孵育。使用超敏ECL发光液依照其说明书步骤进行检测。以上试验至少重复3次。

2 结 果

2.1 AGE-LDL及瑞舒伐他汀对mBMMCs合成和分泌炎性因子TNF-α、IL-6、MMP-9的影响 mBMMCs经AGE-LDL刺激作用6 h后，RT-PCR检测显示,与Control组比较，AGE-LDL(5.0 μg/ml、50.0 μg/ml)组、LPS组TNF-α、IL-6 及MMP-9 mRNA表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，其中AGE-LDL 50 μg/ml亚组表达量最高；n-LDL组与Control组比较，TNF-α、IL-6和MMP-9 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),见表1。瑞舒伐他汀则可下调AGE-LDL诱导的TNF-α、IL-6和MMP-9 mRNA表达，差异有统计学意义(P<0.05)，但进一步调高瑞舒伐他汀浓度至50 mmol/L效果未再见增强，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。AGE-LDL刺激24 h后,细胞培养上清的ELISA检测结果与上述炎性指标mRNA表达结果一致，见表3。

表1 不同浓度的AGE-LDL对mBMMCs TNF-α、IL-6及MMP-9 mRNA表达影响

表2 不同浓度的瑞舒伐他汀对AGE-LDL促mBMMCs炎性因子TNF-α、IL-6及MMP-9 mRNA表达的影响

表3 瑞舒伐他汀对AGE-LDL促mBMMCs炎性因子TNF-α、IL-6及MMP-9分泌的影响

3 讨 论

肥大细胞来源于骨髓造血干细胞，经外周循环后在相关细胞因子的作用下分化成熟，并经外界刺激后能够活化释放其胞内多种活性物质，参与介导过敏反应和免疫炎性反应。相关研究表明，动脉粥样硬化病变的血管外膜及斑块内均聚集有大量肥大细胞，激活后释放胞内生物活性物质，介导巨噬细胞吞噬，损伤内皮功能，调节脂质转运，促进血管平滑肌增殖及向泡沫细胞转化，促使炎性细胞迁移，诱导黏附分子表达，调节免疫反应，从而参与AS的发生与发展[7-8]。而激活的肥大细胞所释放的炎性因子TNF-α、IL-6、MMP-9与动脉粥样硬化密切相关[9]。

图1 AGE-LDL及瑞舒伐他汀对mBMMCs MAPK和NF-κB信号通路激活的影响

表4 AGE-LDL及瑞舒伐他汀对mBMMCs MAPK和NF-κB信号通路激活的影响

表5 p38-MAPK、ERK1/2、NF-κB抑制剂对AGE-LDL促TNF-α、IL-6及MMP-9分泌的影响

AGE-LDL作为一种不可逆的非酶糖基化产物，由机体内的低密度脂蛋白在长期高糖环境下作用生成。与正常人相比，糖尿病患者体内的AGE-LDL水平明显升高，且其升高的水平与动脉粥样硬化和冠心病的罹患风险呈正相关[10]。AGE-LDL通过增加血小板聚集，诱导细胞凋亡，降低血管活性物质NO的合成，增加氧化应激，调节血管内皮黏附分子(VCAM-1)及巨噬细胞清道夫受体表达，降低LDL的转运，诱发血管损伤等一系列机制，促进AS的发生和发展[11]，是糖尿病致动脉粥样硬化的重要病因。以往研究发现，经AGE-LDL免疫过的糖尿病apoE和LDLR(-/-)小鼠的AS进程可得到有效抑制[12]。目前，AGE-LDL针对血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞产生作用及其机制的研究均有相关文献报道[13]，而其对肥大细胞作用如何尚无相关报道。Sick等[14]的研究显示，晚期糖基化终产物(AGEs)在短时间内(10 min内)即可激活肥大细胞，促使肥大细胞释放组胺。由此笔者推测，同样具有促炎效应的AGE-LDL亦极有可能对肥大细胞具有类似激活效应，使其分泌大量炎性介质，促使糖尿病动脉粥样硬化易损斑块形成，发生急性血栓事件。

本实验发现,AGE-LDL能够促进mBMMCs分泌炎性介质TNF-α、IL-6、MMP-9。AGE-LDL诱导肥大细胞活化的作用可能是糖尿病患者易患动脉粥样硬化及冠心病的病因之一。

他汀类药物除能强效降低血总胆固醇及LDL-C水平，还具有改善血管内皮功能、抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移、抗氧化、抗炎、抑制血小板聚集等作用，防止动脉粥样硬化的形成，稳定和缩小动脉粥样硬化斑块，从而显著降低AS高危患者主要心血管事件的发生率和病死率。目前指南推荐，对糖尿病伴心血管疾病者，无论其基线LDL-C水平如何，均建议采用他汀类药物治疗。现有多项研究表明，阿托伐他汀、辛伐他汀和氟伐他汀等临床常用的他汀类药物均可抑制肥大细胞分泌活性炎性介质，稳定肥大细胞[15]。本研究发现，作为目前血脂管理中优选的他汀类药物，瑞舒伐他汀能够抑制AGE-LDL诱导mBMMCs活化、分泌促炎性因子，具有稳定肥大细胞的作用。

促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信号通路作为真核生物信号传递网络中的重要途径之一，参与介导基因表达调控及细胞质功能活动。大多数细胞内存在MAPKs信号转导通路，在细胞外被刺激激活后，形成不同转导通路将信号转导至胞内及核内，参与调节细胞增殖、分化、转化及凋亡等过程。

NF-κB是细胞内重要的核转录因子，在调节炎性反应的免疫应答中起关键作用，其过度激活与细胞凋亡、损伤应激密切相关[16]。现有文献报道，AGEs能够通过激活NF-κB信号通路诱导泡沫细胞形成，而肥大细胞激活后生成的多种炎性因子如TNF-α、IL-6等均又与NF-κB信号通路的激活相关[17-18]。

本研究发现,AGE-LDL能够激活p38 MAPK、ERK1/2和NF-κB信号通路，促进磷酸化p38 MAPK、ERK1/2和NF-κB的表达，对JNK信号通路则无激活作用。瑞舒伐他汀能够抑制AGE-LDL所诱导的p38 MAPK、ERK1/2和NF-κB激活。ERK1/2抑制剂PD98059、NF-κB抑制剂PDTC和瑞舒伐他汀均能够抑制AGE-LDL诱导mBMMCs合成和分泌促炎性介质。而P38抑制剂SB203580则无该作用。上述结果表明，AGE-LDL主要是通过激活ERK1/2和NF-κB信号通路激活mBMMCs，促进其合成和分泌TNF-α、IL-6等炎性因子。该激活效应能够被瑞舒伐他汀所抑制，其作用可能通过其对ERK1/2和NF-κB信号通路的抑制得以实现。

总之，本实验初步明确了AGE-LDL对肥大细胞活化的影响及其相关的分子机制，并且发现瑞舒伐他汀具有稳定肥大细胞的作用，为糖尿病合并AS的防治提供了新的理论基础。必须指出的是，AS在人体内的发生发展过程相当复杂，本研究作为体外单一因素研究，难免存在一定局限性。随着肥大细胞与AS研究的不断深入，本研究将会为糖尿病合并AS的形成机制和防治提供新视角和新靶点。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

赵馨娜：设计研究方案，实施研究过程，统计分析，论文撰写；刘学波：提出研究思路，论文修改和审核;吴宗贵：课题设计，论文审阅和修改