基于数据挖掘与网络药理学探讨徐学功治疗冠心病PCI术后中药使用规律与作用机制*

张静美，陈晓阳，秦庆广，徐学功

（1.河南中医药大学研究生院，河南 郑州 450046；2.南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515；3.河南中医药大学附属郑州市中医院，河南 郑州 450007）

冠心病（coronary heart disease，CHD）是一种常见的心血管疾病，具有高病发率、高死亡率的特点[1]。近年来，随着社会经济的发展，心血管疾病的病发率日益提高。冠状动脉造影是诊断冠心病的“金标准”，在发现“罪犯血管”后，可以续行经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention,PCI），简称PCI术，在一定程度上降低了由于急性心血管事件导致的高死亡率，但远端微栓塞进入冠状动脉微循环仍限制了进一步的心肌抢救[2]。同时，PCI术后血管的再狭窄率居高不下，相关症状的控制情况仍不理想，西药相关的副作用亦十分多见。中医善于从整体出发，运用辨证论治的方法遣方用药，可以有效改善冠状动脉微循环，能够较好地改善心功能，亦能在脂代谢、糖代谢、RASS系统调控等方面达到很好的“上游”治疗目的，不仅弥补了单纯介入治疗的不足，同时能够减少西药的不良反应。对于冠心病的中药使用规律，已有学者做过大量研究，但冠心病PCI术后的中药使用情况及相关药理学作用机制的研究仍未得到学界重视[3-4]。

仝小林指出：“态靶辨证”是当代中医辨证论治的新模式，既要在宏观整体层次去把握疾病本质，更要从微观靶点层次来提高辨证论治的精准性[5]。徐学功教授师从于仝小林并长期从事于中西医结合心血管领域的临床与科研，在冠心病PCI术后的中医药治疗方面秉承了仝小林“态靶辨证”的思想。徐学功教授认为气虚血瘀证是冠心病的主要证型，在PCI治疗前，患者证型主要以血瘀为主，而PCI治疗后的早期阶段血瘀表现仍然明显，进入慢性期以后气虚的本质慢慢显现，这主要是因为PCI治疗在一定程度改善了患者标实的状况，但“络脉”闭塞的情况仍然存在[6]。徐学功教授主张在传统用药的基础上吸纳西医关于冠心病靶向治疗的理念，以提高辨治的精准性。故本文搜集整理了徐学功教授在“态靶辨证”思想指导下治疗冠心病PCI术后的方药，并利用数据挖掘与网络药理学的方法分析潜在的用药规律与作用机制，为后续的临床与科研提供一定帮助。

1 资料与方法

1.1 处方来源 从郑州市中医院门诊与住院病历系统调取徐学功教授治疗冠心病PCI术后的中医处方，日期选择为2017年6月1日至2020年6月1日。

1.2 纳入标准（1）方药信息显示完整，药名、剂量清楚；（2）明确诊断为冠心病PCI术后；（3）使用方法为“口服”的方剂。

1.3 排除标准（1）未记录具体方药（包括单药、处方不完整及无处方等类型）；（2）“口服”以外的其他使用方法，如塌渍、熏蒸、外用、穴位贴敷等；（3）同一病人或不同病人的相同方药只录入一次。

1.4 中药录入 根据《中药学》和《中华药典》确定中药正名，去除炮制法、产地、别称的影响，对部分药物进行统一规范化处理，比如姜半夏、法半夏、半夏统一为半夏，茯苓、云茯统一为茯苓等。先由一人操作中医传承辅助平台软件[7]，将上述处方录入系统构建方剂数据库。为确保数据的准确性，由另外两人进行核对，核对完成后综合结果进行更正处理。

1.5 用药规律分析 运用中医传承辅助平台频数统计功能，筛选出高频药物，得到药物四气、五味、归经等结果。其次，将支持度个数设置为20，置信度设置为0.6，进行组方规律分析与规则分析。

1.6 核心药物有效成分及靶点获取 将核心药物组合药物逐次输入到TCMSP[8]数据库中（https://tcmspw.com/tcmsp.php），设置口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18进行筛选，得到核心药物有效成分及作用靶点，将上述靶点导入到UniProt数据库[9]（https://www.uniprot.org/）中获取所有靶点的基因名。

1.7 疾病-药物共同靶基因的获取 在人类基因数据库GeneCards[10]（https://genecards.weizmann.ac.il/v3/）中以“coronary heart disease”为关键词进行搜索，获取冠心病的靶基因，将上述药物靶基因与疾病靶基因导入到Draw Venn Diagram网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中绘制韦恩图，并得到“疾病-药物”共同靶基因。

1.8 关键靶点PPI网络的构建 将上述“疾病-药物”共同靶基因导入到STRING网站[11]（https://string-db.org/）中，选取物种为“Homo sapiens”，得到靶点蛋白之间的相互作用关系。导出蛋白质互作网络文件后，利用Cytoscape[12]软件优化图形，并根据度值获取PPI[13]网络中排名前10的关键基因（Hub Gene）。PPI网络中，靶点以节点显示，以边相连接，关键靶点的边更加密集，表示在PPI网络所起到的作用就更大。

1.9 GO富集分析与KEGG富集分析 将“疾病-药物”共同基因导入到David数据库中，选择物种为“Homo sapiens”进行GO生物功能富集分析[14]与KEGG信号通路富集分析[15]。

1.10 成分-靶点-信号通路网络图 将药物活性成分、作用靶点、信号通路导入Cytoscape 3.6.0软件中，构建活性成分-作用靶点-信号通路网络图。

2 结 果

2.1 处方获取与用药规律分析 根据上述纳入标准与排除标准，共纳入111首方剂。将其导入中医传承辅助平台软件，对111首方剂中的中药进行用药频数分析，共使用179味中药，频次前10名的药物见图1。药物归经、四气、五味统计结果见图2~4。点击中医传承辅助平台的“药物模式”，得到13个高频药对，包含中药10味，见表1。点击中医传承辅助平台的“规则分析”，得到药物组合规则分析。“关联规则”的含义：当某药物出现在一首方剂中，其相伴随的药物组合出现的概率。药物规则分析，见表2。点击中医传承辅助平台的“网络展示”功能，得到10味中药之间相互关系的网络展示图，见图5。

图1 使用频数排名前10的药物

图2 药物归经统计分析图

图3 药物四气属性频数分布

图4 药物五味属性频数分布

表1 根据关联规则分析得到的高频药物组合

表2 药物关联规则分析

图5 药物组合网络展示图

2.2 核心药物的有效成分及靶标 从TCMSP网站共得到川芎有效成分7个，丹参有效成分50个。再将上述有效成分分别输入到TCMSP网站再次检索，得到有效成分作用靶点，去重后共计61个，然后再将这些靶点蛋白导入到Uniprot网站转化为相应的基因名。

2.3 “疾病-药物”共同靶基因 从GeneCards网站获取到冠心病靶基因6 810个，将疾病与药物靶点导入到Draw Venn Diagram网站进行韦恩图分析，得到“疾病-药物”共同靶基因53个。（见图6）

图6 “药物-疾病”共同基因韦恩图

2.4 关键靶点PPI网络 将上述53个共同基因导入到STRING数据库后得到关键PPI网络图，见图7。将PPI网络以TSV格式保存后，在Cytoscape软件中打开，根据度值得到排名前10的Hub基因（核心基因），见图8。

图7 关键靶基因PPI网络

图8 度值排名前10的Hub基因

2.5 GO富集分析与KEGG通路富集分析 将上述53个“疾病-药物”共同靶基因导入到David数据库进行GO富集分析，与KEGG通路富集分析，根据Pvalue排名将结果可视化其中，GO和KEGG就是基于不同的分类思想而储存的基因相关功能的数据库。基因本体富集分析（GO分析），包括3个方面，即生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。根据GO富集分析结果显示，“丹参-川芎”有效成分具有类固醇结合、序列特异性DNA结合、G蛋白偶联乙酰胆碱受体活性等多个生物功能，能够影响细胞核、突触、突触后模等多个细胞组分，从而参与DNA转录、细胞凋亡的负调控、乙酰胆碱受体信号传导、细胞内信号通路传导、心率调节、突触传递等多个生物过程，进而治疗冠心病PCI术后的各种心血管相关症状。KEGG通路富集分析显示，“丹参-川芎”药对有效成分可以参与癌症相关信号通路、乙型肝炎信号通路、PI3K-Akt信号通路、甲状腺激素信号通路等。（见图9~12）

图9 生物过程富集分析结果

图10 细胞组分富集分析结果

图11 分子功能富集分析结果

图12 KEGG信号通路富集分析结果

2.6 “丹参-川芎”药对成分-靶点-通路网络分析 为了更清晰地展现“丹参-川芎”药对成分、核心靶点与通路之间的关系，使用Cytoscape软件构建通路-活性成分-核心靶点网络。网络图包含节点与边。黄色节点代表药物有效成分，绿色节点代表中药名称，蓝色节点代表靶基因，红色节点代表信号通路。边表示节点之间的联系，边越多，则节点在网络图中的作用越大。网络图可以直观展示出“丹参-川芎”具有通过多成分、多靶点、多通路相互协调作用于冠心病PCI术后的特点。（见图13）

图13 药物成分-靶点通路网络图

3 讨 论

本研究采用数据挖掘的分析方法，研究了徐学功教授治疗冠心病PCI术后的111首方药，共179味药物。利用中医传承辅助平台，发现频数排名前10的依次为甘草、丹参、川芎、黄芪、当归、桂枝、赤芍、茯苓、人参、红花，可见药物功效主要集中在活血、补气、温阳通脉等方面。归经排名靠前的药物分别为心经、脾经、肝经、肺经、胃经等，以归心经最多。药物四气属性分布排名为温、寒、平、热、凉，药物温性频数高达510，占比近50%，反映了治疗冠心病PCI术后以温通心脉为主的治疗大法。而五味属性排名依次为甘、苦、辛等。根据关联规则发现高频药物组合排名靠前的有川芎-丹参、川芎-黄芪、川芎-甘草、红花-川芎、川芎-当归、丹参-黄芪、丹参-甘草、赤芍-丹参、黄芪-甘草、甘草-茯苓、甘草-桂枝、甘草-当归、党参-甘草。而药物置信度排名为川芎—＞丹参、红花—＞川芎、黄芪—＞丹参、赤芍—＞丹参、黄芪—＞甘草、茯苓—＞甘草、桂枝—＞甘草、党参—＞甘草。可见“丹参-川芎”药对在治疗冠心病PCI术后中具有重要作用，同时黄芪在使用频数与配伍关系上排名也较高，这与徐学功教授在冠心病PCI术后气虚血瘀本质的认识是一致的。《本草纲目》曰：“丹参活血，通心包络，治疝痛。”《别录》云：“丹参养血，去心腹痼疾结气，腰脊强脚痹，除风邪留热。久服利人。”《日华子本草》云：“川芎治一切血，补五劳，调众脉，破症结宿血，养新血……及排脓消瘀血。”可见中医学早就认识到“丹参-川芎”具有活血、化瘀、通心脉的作用。

通过网络药理学的方法，得到了“丹参-川芎”药对与疾病的共同基因，并通过PPI网络获取了其中度值前10名的核心基因为TP53、MYC、EGFR、FOS、IL-6、ESR1、CCND1、VEGFA、CASP3、ERBB2。骨髓细胞瘤癌基因（MYC）具有转录因子的作用，可促进众多靶基因的表达，从而在细胞、组织和生物体水平上调控凋亡、增殖和代谢等生理过程。还可以通过驱动免疫细胞中多种代谢基因的表达，从而免疫细胞的分化和激活等起到调控作用[16]。有研究表明雌激素受体1（ESR1）的CC基因型与次要等位基因-397C在男性中有较高的冠心病风险，另外一项Meta分析也佐证了这个观点[17-18]。血管内皮生长因子A（VEGFA）信号传导对心肌融合具有直接影响，能够以剂量依赖性方式调节心脏的形态发生，还可以调节正常或病理性血管内皮生长[19-20]。

根据GO富集分析结果显示，“丹参-川芎”有效成分具有类固醇结合、序列特异性DNA结合、G蛋白偶联乙酰胆碱受体活性等多个生物功能，能够影响细胞核、突触、突触后模等多个细胞组分，从而参与DNA转录、细胞凋亡的负调控、乙酰胆碱受体信号传导、细胞内信号通路传导、心率调节、突触传递等多个生物过程，进而治疗冠心病PCI术后的各种心血管相关症状。

KEGG通路富集分析显示，“丹参-川芎”药对有效成分可以参与癌症相关信号通路（Pathways in cancer）、乙型肝炎信号通路（Hepatitis B）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、甲状腺激素信号通路（Thyroid hormone signaling pathway）等信号通路。有研究表明以丹参为主要组成的方剂可以降低磷酸酶基因，通过PI3K-Akt信号通路抑制大鼠细胞凋亡，减轻心肌缺血再灌注损伤，还可以制炎症和氧化应激水平从而保护心肌，降低动脉粥样硬化炎症反应[21-22]。丹参酚酸B可以调控VEGF等靶点，而促进心肌梗死后的血管新生[23-24]。另外，丹参中的二氢异丹参酮Ⅰ、丹酚酸B等成分可以广泛介导多个癌症相关信号通路，对细胞的分化、增殖、凋亡起到作用[25-26]。研究表明川芎可以作用于雌激素受体α（ESRα）和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）等促进血管生成，还可以通过PI3KAkt信号通路显著降低血脂水平及动脉粥样硬化程度[27-28]。

综上所述，本研究利用数据挖掘的方法分析了“态靶辨证”指导下的徐学功教授治疗冠心病PCI术后的中医处方，从宏观症候与微观作用机制作出阐释，说明了“态靶辨证”客观的科学性。通过数据挖掘得到了核心药物组合“丹参-川芎”，随后利用网络药理学探讨了该核心药物组合中的活性成分治疗冠心病PCI术后潜在的作用机制，为后续的中医药治疗及机制研究提供了一定的参考。