西红花苷对重症胰腺炎大鼠炎症反应及细胞凋亡水平的抑制作用*

谢松波，胡 卓，吕 扬，陈华文

（1.监利市人民医院，湖北 监利 433300；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉 430030）

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）属于临床上常见的急腹症，其临床表现病情危重、发病进展快、死亡率高，这是由于炎症因子的过度释放导致肠黏膜损伤，引发全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征，从而加剧病情[1-3]。因此，控制或者减轻重症胰腺炎病情具有重要的临床价值。西红花苷（Crocin），又称为藏红花素，是西红花（藏红花）的主要活性成分，具有良好的抗氧化、抗肿瘤、降血脂、降血压等作用[4-5]。研究表明西红花苷对脑、心肌等组织的损伤具有一定的保护作用[6-7]。本研究将通过建立SAP大鼠模型并给予西红花苷治疗，通过检测相关指标来进一步探讨西红花苷对重症胰腺炎引起的胰腺组织损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物8周龄SPF级健康雄性SD大鼠32只，体质量190~220 g，由北京安凯毅博生物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK（京）2017-0006。饲养于温度26~28℃、湿度50%~60%的适宜条件下，光照/黑暗时间为12 h/12 h，使用无菌水和饲料饲养1周后进行造模处理。实验经监利市人民医院伦理委员会批准，编号：20181106X。

1.2 药物与试剂 西红花苷（南通飞宇生物科技有限公司，货号：FY1698）；牛黄胆酸钠（北京索莱宝科技有限公司，货号：T8510）；大鼠淀粉酶（amylase，AMS）ELISA试剂盒（江苏江莱生物科技有限公司，货号：JL20962）；大鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（货号：PT516）；大鼠白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA试剂盒（货号：PI303）；大鼠白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒（货号：PI328）；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（红色荧光）（货号：C1089）；苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin，HE）（货号：C0105）（上海碧云天生物技术有限公司）；Bcl2相关X蛋白（Bcl2 associated X protren，Bax）兔单克隆抗体（货号：ab32503）；Janus蛋白酪氨酸激酶2（Janus kinase 2，JAK2）兔单克隆抗体（货号：ab108596）；信号转导和转录激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）兔单克隆抗体（货号：ab68153）；β-肌动蛋白（β-actin）兔多克隆抗体（货号：ab8226）；山羊抗兔IgG H&L（HRP）（货号：ab205718）[艾博抗（上海）贸易有限公司]；PrimeScriptTMRT reagent Kit（货号：RR037A）、Premix Ex TaqTM（货号：RR390A）[宝日医生物技术（北京）有限公司]；裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved Cystein aspartic protease 3，cleaved-Caspase-3）兔单克隆抗体（货号：9661S）；p-JAK2兔单克隆抗体（货号：3771S）；p-STAT3兔单克隆抗体（货号：9145S）（上海优宁维生物科技股份有限公司）。

1.3 主要仪器7500型实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；DM1000 LED正置显微镜、DM2000荧光显微镜（德国Leica公司）；Multiskan Sky全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；CL-1000i全自动化学发光仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；Microfuge 20高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）。

1.4 造模与分组 将32只大鼠随机分为假手术组、模型组、西红花苷低剂量组、西红花苷高剂量组，每组8只。模型组和西红花苷低、高剂量组大鼠采用向胆胰管内注射5%牛黄胆酸钠建立SAP大鼠模型[8]。采用异氟烷吸入式麻醉大鼠，经腹正中切口进入腹腔，找到十二指肠和胆胰管并用血管夹夹闭，逆行胆管匀速注射5%牛黄胆酸钠（0.011 mL/100 g）。注射后5~10 min肉眼观察胰腺组织水肿、胰胆管周围组织出现砖红色改变，即建模成功。去除血管夹，关腹。假手术组大鼠仅开腹，翻动十二指肠和胰腺数次后关腹。

1.5 实验给药 给药前，西红花苷加入生理盐水溶解，制成质量浓度为200 μg/mL的药液并进行分装保存备用。造模成功后，西红花苷低剂量组大鼠尾静脉注射25 mg/kg西红花苷溶液，西红花苷高剂量组大鼠尾静脉注射50 mg/kg西红花苷溶液[9]，模型组和假手术组大鼠静脉注射等量的生理盐水，1次/d，连续注射1周。

1.6 观察指标

1.6.1 ELISA法检测大鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-6含量 所有大鼠在治疗后，抽取腹主动脉血4 mL，3 000 r/min离心10 min，收集上层血清。按照大鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA检测试剂盒的使用说明书测定样品的吸光度值，计算含量。

1.6.2 HE染色检测大鼠胰腺组织病理形态学改变 颈椎脱臼法处死各组大鼠，取大鼠胰腺组织制成标本（0.5cm×0.5cm），使用4%甲醛溶液进行固定，然后进行石蜡包埋、脱水并制成切片，进行苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察各组大鼠胰腺组织病理变化。

1.6.3 TUNEL法检测细胞凋亡 将制备的切片进行脱蜡处理，滴加20 μg/mL蛋白酶K，37℃孵育30 min，用1×PBS溶液洗涤3次。然后滴加50 μL TUNEL检测混合液（5 μL TdT酶+45 μL荧光标记液），37℃避光孵育60 min，1×PBS溶液洗涤3次。用抗荧光淬灭封片液封片后在荧光显微镜下观察。1.6.4 RT-qPCR检测JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达水平取大鼠的胰腺组织，使用Trizol法提取组织中的总RNA，使用逆转录试剂盒进行逆转录，然后通过实时荧光定量PCR检测JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达水平。反应条件为94℃预变性30 s，40个循环扩增反应（94℃5 s，60℃20 s）。以β-actin为内参，采用公式（2-△△Ct）计算其相对表达量。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.6.5 Western blotting检 测Bax、cleaved-Caspase-3、JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3蛋白表达 使用RIPA裂解液提取大鼠胰腺组织中总蛋白，定量后进行SDS-PAGE电泳（80 V 30 min，100 V 90 min）、转膜（100 V，100 min），再使用5%脱脂牛奶室温封闭1 h。加入一抗（1∶1 000）4℃过夜孵育。加入二抗（1∶3 000），室温孵育2 h。通过ECL化学发光法并使用全自动化学发光仪来分析蛋白条带。

1.7 统计学方法 采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清学指标的检测比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及淀粉酶含量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，西红花苷高、低剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及淀粉酶含量均不同程度下降（P＜0.05）；与西红花苷低剂量组比较，西红花苷高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及淀粉酶含量降低（P＜0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠血清炎症因子及淀粉酶含量比较（±s）

表2 各组大鼠血清炎症因子及淀粉酶含量比较（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与西红花苷低剂量组比较，cP＜0.05

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2.2 各组大鼠胰腺组织病理变化情况 假手术组大鼠胰腺组织无炎症细胞浸润、间质水肿等病理性改变；模型组大鼠胰腺组织出现大量炎症细胞浸润、间质水肿及组织坏死；西红花苷低剂量组大鼠胰腺组织组炎症细胞浸润和水肿情况较模型组略有改善；西红花苷高剂量组大鼠胰腺组织炎症细胞浸润显著减少，水肿以及组织坏死得到显著改善。（见图1）

图1 各组大鼠胰腺组织病理变化比较（HE，×100）

2.3 各组大鼠胰腺组织细胞凋亡水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠胰腺组织细胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白相对表达量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，西红花苷高、低剂量组大鼠胰腺组织细胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白相对表达量均不同程度下降（P＜0.05）；与西红花苷低剂量组比较，西红花苷高剂量组大鼠胰腺组织细胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白相对表达量降低（P＜0.05）。（见图2、表3）表3各组大鼠胰腺组织细胞凋亡水平及相关蛋白表达比较（±s）

图2 各组大鼠胰腺组织细胞凋亡及相关蛋白表达情况

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与西红花苷低剂量组比较，cP＜0.05

2.4各组大鼠JAK2/STAT3信号通路相关基因及蛋白表达比较 与假手术组比较，模型组大鼠胰腺组织JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相对表达量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，西红花苷高、低剂量组大鼠胰腺组织JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相对表达量均显著降低（P＜0.05）。

与假手术组比较，模型组大鼠胰腺组织JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，西红花苷高、低剂量组大鼠胰腺组织JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量均显著降低（P＜0.05）；与西红花苷低剂量组比较，西红花苷高剂量组大鼠胰腺组织JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量均显著降低（P＜0.05）。（见图3~4、表4）

图3 各组大鼠胰腺组织JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相对表达量比较 （±s，n=8）

表4 各组大鼠胰腺组织JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量比较（±s）

表4 各组大鼠胰腺组织JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相对表达量比较（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与西红花苷低剂量组比较，cP＜0.05

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3 讨 论

重症急性胰腺炎是临床上常见的急腹症，除带来局部的病理损伤外，还伴随着强烈的全身炎症级联反应，甚至会引起全身多器官衰竭，乃至死亡的发生[10]。重症胰腺炎的治疗方法常包括胃肠减压、抑制胰腺外分泌、抑制胰酶活性、预防性抗生素使用等，但其治疗存在一定的局限性，例如治疗周期长，临床疗效差，并发症多等[11]，因此寻找有效的重症胰腺炎治疗药物具有重要的临床应用价值。

西红花苷具有多重生物学活性。ZAGHOULM S等[12]研究表明西红花苷对博来霉素（bleomycin，BLM）诱导的肺纤维化具有明显的抗氧化、抗炎及抗纤维化作用。LI X等[13]研究表明西红花苷能够通过抑制细胞因子表达来减少类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）的炎症反应。本研究建立了重症胰腺炎SD大鼠模型并采用西红花苷进行治疗，HE染色结果显示，模型组大鼠胰腺组织出现大量炎症细胞浸润、间质水肿以及组织坏死，西红花苷干预后，大鼠胰腺组织炎症细胞浸润显著减少，水肿及组织坏死得到改善。提示西红花苷能够减轻重症胰腺炎的炎症反应，改善胰脏组织损伤。

TNF-α、IL-1β、IL-6在炎症反应引起的重症胰腺炎的发病中起着重要的作用，TNF-α能够介导多种炎症因子（IL-1β、IL-6等）的释放，促进白细胞的趋化反应和黏附，进而损伤胰腺组织[14]。IL-1β是促炎性细胞因子，在重症胰腺炎中参与胰腺组织的破坏和水肿形成[15]。IL-6是一类非特异性炎症因子，参与全身性炎症反应，在机体的抗免疫反应中起到重要的作用[16]。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及淀粉酶含量显著升高；与模型组比较，西红花苷高、低剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及淀粉酶含量均存在不同程度下降。这提示西红花苷通过抑制炎症细胞因子的表达进而降低胰腺组织的炎症水平。本研究结果显示，模型组大鼠胰腺组织细胞凋亡率，以及凋亡相关蛋白Bax、cleaved-Caspase-3表达水平显著升高；西红花苷干预后，大鼠胰腺组织细胞凋亡率，以及Bax、cleaved-Caspase-3蛋白表达水平显著下降。提示西红花苷通过降低细胞凋亡率发挥对重症胰腺炎的保护作用。

JAK2/STAT3信号通路是一个将细胞外信号转导至细胞内的二级联信号，跨膜受体活化后将信号传导至细胞内，参与细胞增殖、分化、凋亡、细胞免疫等过程[17]。LI M等[18]研究表明JAK2抑制剂AG490处理后会降低大鼠促炎性细胞因子的活性，并显著减轻胰腺炎相关的肝损伤。GAO H Y等[19]结果显示在2型糖尿病大鼠模型中二甲双胍能够在高血糖培养条件下激活JAK2/STAT3途径并减轻细胞凋亡。本研究结果显示，模型组大鼠胰腺组织JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达，以及JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表达均升高；西红花苷干预后，JAK2/STAT3信号通路相关指标表达水平均显著下降。这提示西红花苷可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路激活发挥保护作用。

综上所述，西红花苷能够抑制重症胰腺炎大鼠炎症反应及细胞凋亡，对重症胰腺炎大鼠起到保护作用，其机制可能与西红花苷抑制JAK2/STAT3信号通路有关。本研究为临床治疗重症胰腺炎提供了新的思路。