益智方改善东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍的药理作用研究

王 双，王婷婷，田俊娜，张 蕻，施怀生，赵思俊，朴晋华

（1.山西中医药大学，山西 晋中 030619；2.山西省食品药品检验所，山西 太原 030001）

学习记忆障碍是一种临床常见病症，其发病机制十分复杂，不仅影响了人们的工作和生活，严重者还会诱发其他疾病。近年来，中医药在改善学习记忆障碍方面越来越受到研究者们的关注[1]。

益智方是在经典名方六味地黄丸的基础上经化裁重组而得，方中熟地黄质润入肾，填精益髓，滋补阴精，养血补虚，为君药；山茱萸、山药为臣药，山茱萸可补养肝肾，并且能够摄精，山药双补脾肾，此三味药既能够补肾固精又可以补脾来助后天生化之源；远志具有安神益智的功效，可治惊悸、健忘、失眠，《神农本草经》有言，其“补不足，除邪气，利九窍，益智慧，耳聪目明，不忘，强志倍力。”益智仁健脾补肾，与上四味药合用，共奏补肾固精之功。本方以补为主，具有填精益髓、养血补虚、安神益智的功效。现代研究表明熟地黄[2]、山茱萸[3]、山药[4]、远志[5]及益智仁[6]等中药对学习记忆障碍具有明显的改善作用。

本实验以东莨菪碱致记忆障碍小鼠为动物模型，分别通过跳台实验、避暗实验及Morris水迷宫实验等行为学指标，考察益智方改善学习记忆障碍的药理作用及其机制，为进一步临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明种SPF级雄性小鼠60只，体质量18～20 g，购于北京斯贝福生物技术有限公司，生产许可证编号：SCXK（京）2019-0010。小鼠在山西省食品药品检验所屏障环境饲养，饲养温度24～26℃，相对湿度45%～55%，期间自由进食和进水。实验期间小鼠健康状况良好，实验结束后小鼠采用CO2安乐死，实验经山西省食品药品检验所实验动物伦理委员会审查并批准实施。

1.2 药物与试剂 益智方，生药临床拟用量为14 g/d，将熟地黄、山茱萸、山药、远志和益智仁除去杂质后，取处方量浸泡，加入10倍于药材质量的水煎煮2次，每次煎煮1 h，过滤，合并滤液并离心，浓缩药液到所需浓度；按体表面积计算，20 g小鼠相当60 kg成人用量的0.003倍，小鼠的生药等效剂量为14 g×0.003/0.02（kg）=2 g/kg。以等效剂量作为低剂量，中、高剂量分别为低剂量的2、4倍。东莨菪碱（郑州赛科药业科技有限公司，批号：20190316）；乙酰胆碱（ACh）ELISA试剂盒（批号：202008）、胆碱乙酰酯酶（AchE）ELISA试剂盒（批号：202008）、胆碱乙酰转移酶（ChAT）ELISA试剂盒（批号：202008）[盈芯生物科技（上海）有限公司]。

1.3 主要仪器SDT-8跳台实验视频分析系统、PAT-8避暗实验视频分析系统、WMT-100 Morris水迷宫视频分析系统（成都泰盟软件有限公司）；T-2000电子天平（美国双杰兄弟集团有限公司）。

1.4 造模与给药 将60只小鼠随机分为空白组、模型组、益智方低剂量组、益智方中剂量组、益智方高剂量组，每组12只。益智方低、中、高剂量组小鼠灌胃给予益智方溶液，生药剂量分别为2、4、8 g/kg；空白组和模型组小鼠灌胃给予等体积纯化水，灌胃体积10 mL/kg，1次/d，连续30 d。给药30 d结束后进行行为学测试。行为学测试期间持续给药，在每项实验前30 min，除空白组外，其余各组小鼠分别腹腔注射东莨菪碱（5 mg/kg）制备学习记忆障碍模型，空白组小鼠腹腔注射等体积生理盐水[7]。据行为学相应的测试指标（跳台实验、避暗实验的潜伏期、错误次数，以及Morris水迷宫的逃避潜伏期、逃逸平台滞留时间和有效进入次数），模型组与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.05），说明造模成功。

1.5 观察指标

1.5.1 跳台实验[8]持续给药第31天，将小鼠放入反应箱内先适应环境3 min，然后再将小鼠放置反应箱内的铜栅上，立即通以36 V的交流电，如此训练5 min。24 h后为测试阶段。记录小鼠第一次跳下高站台的时间即为跳台潜伏期时间，3 min内受到电击的次数即错误次数。

1.5.2 避暗实验[9]持续给药第33天，先将各组小鼠放入避暗箱（黑色长方形避暗箱分明暗两室，暗室箱底通有电流）的明室中，不通电的情况下自由活动3 min；再将小鼠赶到暗室通电，每只训练5 min，在间隔24 h后正式实验时将小鼠面部背向洞口放入明室，拉开隔板，并同时启动计时器，小鼠第一次到达暗室的时间即为潜伏期；进入暗室受到电击的次数即错误次数。记录每只小鼠的潜伏期和5 min内小鼠进入暗箱的错误次数。

1.5.3 Morris水迷宫实验[10]Morris水迷宫由直径150 cm、高70 cm的圆形水池组成，池中等分划为4个象限，水中加入钛白粉使其浑浊，水面高于平台表面1～2 cm，水温控制在（24.0±0.5）℃，采用图像采集系统记录小鼠的逃避潜伏期、逃逸平台滞留时间、有效区域进入次数等。（1）定位航行实验：持续给药第35天，在水池中第Ⅱ象限的中心位置放置平台，每天依次在每个象限训练每只小鼠，若小鼠60 s内未能找到平台，则将小鼠引导至平台上，其潜伏期为60 s，无论小鼠60 s内是否能找到平台，均让其在平台停留15 s，并记录小鼠入水至找到平台的时间，即逃避潜伏期。（2）空间探索实验：在末次定位航行试验结束24 h后进行1次空间探索实验，先撤走平台，随后将小鼠面向池壁放入水中，入水口选择平台对面的Ⅳ象限，时间为60 s，记录小鼠穿越原平台位置的次数和原平台象限游泳区域进入次数作为检测指标来反映空间记忆能力。

1.5.4 脑组织中相关指标检测 行为学实验结束后，将小鼠迅速断头取脑，并冻存于-80℃冰箱保存备用。测定前，精确称量小鼠脑组织质量，加入9倍量的生理盐水制成10%组织匀浆液，待测；4℃、3 000 r/min下离心20 min，然后取上清液，按照试剂盒说明书的方法步骤检测ACh、AchE、ChAT的含量。

1.6 统计学方法 实验数据均采用SPSS 23.0统计软件进行处理，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠跳台潜伏期和错误次数比较 与空白组比较，模型组小鼠跳台潜伏期显著缩短（P<0.01），错误次数显著增加（P<0.01），表明造模成功。与模型组比较，益智方低、中、高剂量组小鼠跳台潜伏期均显著延长（P<0.05或P<0.01），错误次数均显著减少（P<0.01）。提示益智方能明显改善东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍。（见图1）

图1 各组小鼠跳台潜伏期和错误次数比较（±s，n=12）

2.2 各组小鼠避暗潜伏期和错误次数比较 与空白组比较，模型组小鼠避暗潜伏期显著缩短（P<0.01），错误次数显著增加（P<0.01），表明造模成功。与模型组比较，益智方低、中、高剂量组小鼠小鼠避暗潜伏期明显延长（P<0.01或P<0.05），错误次数显著减少（P<0.01）。提示益智方能明显改善东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍。（见图2）

图2 各组小鼠避暗潜伏期和错误次数比较（±s，n=12）

2.3 各组小鼠Morris水迷宫实验结果

2.3.1 各组小鼠定位航行实验逃避潜伏期比较 定位航行实验：在连续5 d定位航行实验中，随着训练时间的延长，空白组小鼠找到平台的潜伏期逐渐缩短，与空白组比较，模型组小鼠找到平台的潜伏期明显延长（P<0.01），表明造模成功。与模型组比较，益智方高剂量组小鼠在第1、2、4天找到平台的潜伏期明显缩短（P<0.05）；益智方的低、中、高剂量组小鼠在第5天找到平台的潜伏期明显缩短（P<0.05）。（见图3）

图3 各组小鼠定位航行实验逃避潜伏期比较（±s，n=12）

各组小鼠训练第5天的典型游泳热力图见图4。空白组小鼠以最短的时间找到了平台，而模型组小鼠表现为沿着池壁寻找平台，无法确定平台位置，益智方高剂量组小鼠寻找平台的模式明显优于模型组，益智方低、中剂量组小鼠寻找平台模式稍逊，但最终均确定了平台的位置。提示益智方能明显改善东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍。

图4 各组小鼠Morris水迷宫训练第5天定位航行典型游泳热力图（n=12）

2.3.2 各组小鼠逃逸平台滞留时间和有效区域进入次数比较 空间探索实验：与空白组比较，模型组小鼠逃逸平台滞留时间明显缩短（P<0.01），60 s内有效区域进入次数明显减少（P<0.01），表明造模成功。与模型组比较，益智方低、中、高剂量组小鼠逃逸平台滞留时间均明显延长（P<0.05或P<0.01）；益智方低、中、高剂量组小鼠60 s内有效进入次数明显增加（P<0.05或P<0.01）。提示益智方能明显改善东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍。（见图5）

图5 各组小鼠逃逸平台滞留时间和有效区域进入次数比较（±s，n=12）

2.4各组小鼠脑组织中ACh、ChAT、AchE含量比较 与空白组比较，模型组小鼠脑组织中ACh、ChAT含量明显减少（P＜0.05或P＜0.01），AchE含量明显增加（P<0.05）；与模型组比较，益智方中、高剂量组小鼠脑组织中ACh和ChAT的含量显著增加（P<0.05或P<0.01），而AChE含量显著减少（P<0.05）。益智方低剂量组小鼠脑组织中ACh、ChAT、ChAE含量与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表1）

表1 各组小鼠脑组织中ACh、AchE、ChAT含量比较（±s）

表1 各组小鼠脑组织中ACh、AchE、ChAT含量比较（±s）

注：与空白组比较，aP<0.05，bP<0.01；与模型组比较，cP<0.05，dP<0.01

?

3 讨 论

学习记忆是人体生理发育过程中一个极其复杂的过程，涉及多个系统、多个环节、多种因素。东莨菪碱是一种抗胆碱药，能使实验动物学习记忆功能减退，被广泛应用于药理评价和作用机制探讨[11]。本研究成功复制了东莨菪碱所致的小鼠学习记忆障碍模型。

Morris水迷宫是现今研究者们所公认的用来测试空间学习记忆行为学的经典方法，实验动物在水中寻找平台对脑组织中海马体的学习记忆功能反应极其强烈，常被用来测试AD患者或测试年龄相关的学习记忆障碍的研究[12]；跳台实验和避暗实验都是用来测试动物在受到电刺激时对其制造出不利的环境影响，经过若干次训练，通过被动躲避方式躲避其不利环境给它们带来的不利影响，从而评价其学习记忆能力。

ACh广泛存在于脑内且是一种重要的中枢胆碱神经递质，能维持胆碱能系统正常运行和长期记忆的生理基础。研究表明，痴呆患者脑组织中枢神经系统中普遍存在Ach含量降低，Ach在脑中含量的减少可以引起学习记忆障碍[13]，可推测胆碱能通路的受损与学习记忆能力的下降具有因果关系。AchE作为ACh的关键水解酶，通过水解ACh控制胆碱能神经元突触间的信息传递，从而实现对记忆功能的调控，AchE含量升高可造成脑内ACh含量不足导致学习记忆能力下降[14]；ChAT是ACh的合成酶，ACh由胆碱、乙酰辅酶A协助，并在胆碱乙酰转移酶（ChAT）催化下合成，两者的含量及活性直接影响ACh的含量且共同维持着ACh的动态平衡。本实验结果显示，益智方高剂量组小鼠脑组织中AchE含量显著减少，ACh、ChAT含量显著增加，可推测其益智作用是通过调控AchE进而影响了Ach、ChAT含量，从而改善小鼠学习记忆的能力。

以熟地黄、山茱萸、山药、远志、益智仁为主的复方在治疗记忆减退、老年健忘等方面的应用越来越多。现代研究表明[15-21]，熟地黄、远志、益智仁均可改善东莨菪碱致学习记忆障碍模型小鼠抑制的中枢神经系统功能及大脑中乙酰胆碱的功能，其作用机制可能为通过提高ChAT活性、抑制AChE活性来增强胆碱能神经系统功能。本实验结果表明，高剂量益智方可显著提高东莨菪碱致学习记忆障碍模型小鼠脑组织ChAT含量，减少AchE含量，与文献相符。研究[22-26]表明，山茱萸多糖、山药多糖可通过增强脑组织的ATP酶活性、抑制衰老的相关信号节点和通路来减缓东莨菪碱致小鼠脑组织中Aβ的形成，且能通过降低Tau蛋白磷酸化来改善学习记忆障碍。

综上所述，益智方可以改善小鼠东莨菪碱所致学习记忆障碍，该方可能通过胆碱能通路调节机体脑内ACh水平，进而调节胆碱能的相关神经功能，从而改善学习记忆功能。由此可知，益智方可能主要通过调节胆碱能系统达到改善小鼠学习记忆障碍的作用。