温肾育卵汤对PCOS模型大鼠卵巢ERα、ERβ表达的影响*

周 鹭，蒋涵颖，滕红丽

（1.湖北民族大学医学部，湖北 恩施 445000；2.广西国际壮族医院，广西 南宁 530001）

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是临床常见的内分泌代谢紊乱疾病，发病率达6%~10%[1]，占不孕人群的30%~40%，主要由神经、内分泌及代谢系统和卵巢局部调节因子失衡引起，其主要表现为持续性无排卵和卵巢多囊样改变、高雄激素血症、胰岛素抵抗等，其发病具有多因性，与遗传、环境、饮食、生活方式、精神心理等因素密切相关[2-3]。雌激素在生殖系统的发育中起着重要作用，而雌激素作用的主要介体是雌激素受体（Estrogen Receptor，ER），主要分为两类——雌激素受体α（ERα）和雌激素受体β（ERβ），都是下丘脑-垂体-卵巢轴正常运作所必需的受体[4]。ER异常的表达对生殖健康产生了重要影响。PCOS病因的复杂性和表现的多样性使其治疗成为难题，积极探索中医药治疗方法具有重要意义。温肾育卵汤是国医大师治疗排卵障碍的经验方，应用于临床多年，疗效显著。本研究基于PCOS模型大鼠，探讨温肾育卵汤对大鼠卵巢ERα和ERβ的蛋白和基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物6周龄SPF级雌性SD大鼠54只，体质量180~200 g，购自于长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0014。常规颗粒饲料喂养，自由食水，12 h昼夜节律。环境温度24～26℃，湿度40%～70%。适应性喂养1周后开始实验。本实验经医学实验动物管理委员会批准，于广西中医药大学方药重点实验室进行，实验过程完全符合动物实验伦理规范要求。

1.2 药物与试剂

1.2.1 药物 温肾育卵汤，方药组成：当归身9 g，鹿角霜20 g，仙茅9 g，菟丝子20 g，巴戟天15 g，紫石英30 g，熟地黄15 g，党参15 g，白术15 g，蛇床子3 g，艾叶5 g，小茴香2 g，花椒2 g，炙甘草10 g，由广西中医药大学附属医院提供。根据动物和人体等效剂量换算公式及换算系数0.162[5]，按成人（60 kg）为标准体质量，换算成大鼠（100 g为标准）每天给药的高剂量为3.5 g。水煎液制备方法：称取340 g温肾育卵汤药材，以适量清水浸泡1 h，然后用大火将其煮沸，小火维持沸腾状态30 min，分离药液，重新向锅中加入清水，继续以上方法煎煮3次，收集3次煎煮的药液，混匀，置于不锈钢锅中，浓缩药液至97.1 mL，得到浓度为3.5 g/mL的溶液，此浓度为温肾育卵汤高剂量组，保存在4℃冰箱中备用。来曲唑片（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：H19991001，规格：2.5 mg/片）；枸橼酸氯米芬片（塞浦路斯高特制药有限公司，批号：H20140688，规格：50 mg/片），将枸橼酸氯米芬片溶于蒸馏水，制成0.45 mg/mL水溶液备用。

1.2.2 试剂ERα抗体（批号：GTX22746）、ERβ抗体（批号：GTX23577）（欣博盛生物科技有限公司）；ERα一抗（武汉贝茵莱生物科技有限公司，批号：Ab3574）；ERβ一抗（上海艾博抗贸易有限公司，批号：PAB33378）；MaxVision TM HRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司，批号：KIT-5020）。

1.3 主要仪器DM1000型普通正置显微镜（德国徕卡显微系统有限公司）；1658033型垂直电泳仪（美国BIO-RAD公司）；AR224CN型电子分析天平（上海奥豪斯仪有限公司）；Light Cycler 96型全自动实时荧光定量PCR仪（瑞士罗氏诊断产品有限公司）；Multiskan GO型全波长酶标仪（中国赛默飞世尔科技有限公司）。

1.4 PCOS动物模型建立与分组 利用来曲唑法建立PCOS模型[6-8]，取46只大鼠灌胃1%来曲唑羧甲基纤维素溶液[8mL/（kg·d），0.125 mg/mL]，1次/d，连续给药21 d，其余8只大鼠作为正常组，每日给等体积羧甲基纤维素溶液灌胃。造模第7天开始，每天10:00:00进行阴道涂片，观察上皮细胞形态改变，监测大鼠动情周期。连续阴道涂片检查2个周期，大鼠失去规律的动情周期作为建立模型成功。选取造模成功的40只大鼠随机分为模型组、枸橼酸氯米芬片组、温肾育卵汤高剂量组、温肾育卵汤中剂量组、温肾育卵汤低剂量组，每组8只。

1.5 实验给药 自造模第22天开始给药，枸橼酸氯米芬片组大鼠按4.5 mg/（kg·d）灌胃枸橼酸氯米芬片溶液；温肾育卵汤低、中、高剂量组大鼠分别给予低、中、高剂量[8.75、17.50、35.00 g/（kg·d）]温肾育卵汤灌胃，正常组和模型组大鼠相同条件下灌胃等体积蒸馏水，1次/d，连续给药21 d。末次给药后禁食12 h以上，称量大鼠体质量后用10%水合氯醛经腹腔注射麻醉（0.3 mL/100 g），剖开腹腔充分暴露大鼠子宫及附件，将卵巢组织取出，一侧卵巢置4%多聚甲醛中固定，以供病理学和免疫组化检测，另一侧置EP管后放入-80℃冰箱以供Western blotting、RT-PCR检测。

1.6 观察指标

1.6.1 形态学观察 每日观察造模前后大鼠进食、进水量、活动量及毛发状态，自造模开始每周记录一次体质量。

1.6.2 卵巢组织病理学检查 将固定于4%多聚甲醛中的卵巢送至武汉华联科生物技术有限公司进行石蜡包埋切片，HE染色后通过显微镜拍照，Leica Application Suite图像系统采集卵巢组织形态及卵泡发育状况。

1.6.3 免疫组化检测各组大鼠卵巢ERα、ERβ蛋白表达量 由武汉华联科生物技术有限公司对卵巢组织石蜡切片后，免疫组化检测大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白的表达情况。通过显微镜拍照，采集图像，DAB显出阳性为棕黄色。通过Image-Pro plus6.0图像软件对ERα、ERβ蛋白表达量进行分析，计算平均光密度值。

1.6.4 RT-PCR检测各组大鼠卵巢ERα mRNA、ERβ mRNA相对表达量RT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司根据GenBank中所查的mRNA序列设计并合成，序列见表1。用TRNzol法提取卵巢组织的总RNA，用紫外分光光度仪检测RNA的浓度后按照逆转录试剂盒步骤将总RNA逆转录为cDNA。PCR反应条件：预变性：95℃，3 min，1次循环；变性：95℃，10 s，退火：60℃，30 s，40次循环。以GAPDH为内参，计算各组大鼠卵巢ERα mRNA、ERβ mRNA相对表达量。

表1 引物序列表

1.6.5 Western blotting检测各组大鼠卵巢ERα、ERβ蛋白相对表达量 取出适量组织加入裂解液后在低温研磨机上进行研磨，充分裂解后于4℃10 000 r/min离心10 min，取上清液用酶标仪测蛋白浓度，蛋白定量后100℃加热5 min，变性后-20℃保存。每孔以10 μL总量上样到预制胶，140 V电泳约50 min后，250 mA电转2 h，转膜后一抗（1:1 000）4℃孵育过夜，常温孵育二抗ERα（1:500）、ERβ（1:1 000）2 h后显影。用Image J检测灰度值，最终结果以目标蛋白与GAPDH的比值表示ERα、ERβ蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法 通过SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料均以“均数±标准差”（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况观察 给药前，正常组大鼠活动积极，体型适中，进食、进水量正常，毛发光泽、干净；其余各组大鼠活动量明显减少，体型肥胖，毛发旺盛且杂乱，光泽度低，进食、进水量与正常组无明显区别。给药后，与模型组比较，枸橼酸氯米芬片组和温肾育卵汤低剂量组大鼠活动量稍增，毛发和体型状况无明显差别；温肾育卵汤中、高剂量组大鼠活动量增加，毛发更有光泽。

给药前各组大鼠体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；给药后温肾育卵汤中、高剂量组大鼠体质量明显低于给药前（P＜0.05），其余各组给药前后体质量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠给药前后体质量比较（±s，g）

表2 各组大鼠给药前后体质量比较（±s，g）

注：与给药前比较，aP＜0.05，bP＞0.05

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2.2 各组大鼠卵巢组织形态学变化HE染色显示正常组大鼠卵巢可见原始卵泡、成熟卵泡等大小不一的各级卵泡，层次结构清晰，颗粒细胞层次较多且排列整齐，并可见数个黄体；模型组大鼠卵巢可见多个囊状卵泡和闭锁卵泡，颗粒细胞层明显减少且排列杂乱，未见黄体；枸橼酸氯米芬片组大鼠卵巢颗粒细胞较模型组明显增多，可见少量原始卵泡，偶尔可见囊状卵泡和黄体；温肾育卵汤低剂量组大鼠卵巢较模型组颗粒细胞增多，偶尔可见少量原始卵泡，未见黄体；温肾育卵汤中剂量组大鼠卵巢可见大量原始卵泡，颗粒细胞较多，排列杂乱，偶见少量囊状卵泡；温肾育卵汤高剂量组大鼠卵巢可见大量原始卵泡和黄体，颗粒细胞较多且排列整齐，偶见成熟卵泡。（见图1）

图1 各组大鼠卵巢组织形态比较（HE，×200）

2.3 各组大鼠卵巢ERα、ERβ蛋白表达情况 免疫组化蛋白表达阳性显色为棕黄色。正常组大鼠卵巢ERα、ERβ蛋白阳性表达最高，模型组最低。与模型组比较，枸橼酸氯米芬片组和温肾育卵汤低、中、高剂量组大鼠卵巢ERα、ERβ蛋白阳性表达面积呈现不同程度的上升。（见图2）

图2 各组大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白表达情况（免疫组化，×200）

模型组大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白表达水平明显低于正常组（P＜0.01）；枸橼酸氯米芬片组和温肾育卵汤低、中、高剂量组大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白表达水平明显高于模型组（P＜0.01）；温肾育卵汤低剂量组大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白表达水平明显低于枸橼酸氯米芬片组（P＜0.01）；温肾育卵汤中剂量组大鼠卵巢中ERα蛋白表达水平明显低于枸橼酸氯米芬片组（P＜0.01），ERβ蛋白表达水平明显高于枸橼酸氯米芬片组（P＜0.01）；温肾育卵汤高剂量组大鼠卵巢中ERβ蛋白表达水平低于枸橼酸氯米芬片组（P＜0.01），而ERα蛋白表达水平与枸橼酸氯米芬片组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠卵巢中ERα和ERβ蛋白的光密度值比较（±s）

表3 各组大鼠卵巢中ERα和ERβ蛋白的光密度值比较（±s）

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与枸橼酸氯米芬片组比较，cP＜0.01

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2.4 各组大鼠卵巢中ERα mRNA、ERβ mRNA相对表达量比较 模型组大鼠卵巢中ERα mRNA、ERβ mRNA相对表达量明显低于正常组（P＜0.01）；枸橼酸氯米芬片组和温肾育卵汤低、中、高剂量组大鼠卵巢中ERα mRNA、ERβ mRNA相对表达量明显高于模型组（P＜0.01）；温肾育卵汤低、中剂量组大鼠卵巢中ERα mRNA、ERβ mRNA相对表达量明显低于枸橼酸氯米芬片组（P＜0.01）；温肾育卵汤高剂量组大鼠卵巢中ERα mRNA、ERβ mRNA相对表达量明显高于枸橼酸氯米芬片组（P＜0.01）。（见表4）

表4 各组大鼠卵巢中ERα、ERβ基因表达量比较（±s）

表4 各组大鼠卵巢中ERα、ERβ基因表达量比较（±s）

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与枸橼酸氯米芬片组比较，cP＜0.01

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2.5 各组大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白相对表达量比较 模型组大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白相对表达量明显低于正常组（P＜0.01）；枸橼酸氯米芬片组和温肾育卵汤中、高剂量组大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白相对表达量明显高于模型组（P＜0.01），温肾育卵汤低剂量组大鼠卵巢中ERβ蛋白相对表达量明显高于模型组（P＜0.01），而ERα蛋白相对表达量与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；温肾育卵汤低剂量组大鼠卵巢中ERα、ERβ蛋白相对表达量明显低于枸橼酸氯米芬片组（P＜0.01）；温肾育卵汤中剂量组大鼠卵巢中ERα蛋白相对表达量明显低于枸橼酸氯米芬片组（P＜0.01），而ERβ蛋白相对表达量明显高于枸橼酸氯米芬片组（P＜0.01）；温肾育卵汤高剂量组大鼠卵巢中ERα蛋白相对表达量明显高于枸橼酸氯米芬片组（P＜0.01），而ERβ蛋白相对表达量明显低于枸橼酸氯米芬片组（P＜0.01）。（见图3、表5）

图3 各组大鼠卵巢组织中ERα、ERβ蛋白表达图

表5 各组大鼠卵巢组织中ERα、ERβ蛋白相对表达量比较（±s）

表5 各组大鼠卵巢组织中ERα、ERβ蛋白相对表达量比较（±s）

注：与正常组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01；与枸橼酸氯米芬片组比较，cP＜0.01

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3 讨 论

PCOS的病因复杂且尚不明确，可能为下丘脑-垂体-卵巢轴出现调节功能障碍，从而导致ERα和ERβ基因和蛋白的表达异常。雌激素通过ERα调节周期促性腺激素的释放[9]，ERβ的激活可促进卵泡的发生和排卵[10]。研究显示ER基因的敲除可导致卵泡发育异常、早期闭锁卵泡[11-12]，当人体内ER缺乏时，卵巢组织功能会受到严重损伤，可能会导致患者受孕率降低和流产[13-14]。恢复ER的表达有助于改善排卵状况，减少PCOS相关不孕症的发生[15-16]。

班秀文是我国首届国医大师，从事中医、壮医教学，临床医疗和科研工作五十余年，临床尤其擅长治疗妇科疾病。对于不孕症的认识，班老认为“月经不调之妇，鲜有能受孕者”[17]。故对不孕症的治疗，班老首先着眼于调理经候，后人总结为“种子贵先调经，调经不忘治带”[18]。对于排卵障碍的不孕症，班老认为排卵不佳多与肝不生发，肾不作强有关。班老常从调补肝肾着眼，针对不同证候，或温肝肾之阳，或滋肝肾之阴，或益肾填精养血，使肝肾阴阳平秘，精充血足，以助排卵[19-21]。

温肾育卵汤是班秀文治疗排卵障碍性不孕症的验方。方中鹿角霜为君药，温肾以助阳。仙茅补肾助阳、益精血；熟地黄养血滋阴，补精益髓；菟丝子具有补肾益精之功；巴戟天补肾助阳、强筋壮骨；紫石英具有镇心、安神、暖宫之效；上四味共为臣药。党参补中益气，生津养血；当归身补血活血；蛇床子温肾壮阳；艾叶温经散寒；小茴香理气散寒，助阳健运；花椒芳香健胃、温中散寒；上五味共为佐药。炙甘草调和诸药。诸药同用，温补肾阳，健脾养血以助排卵。温肾育卵汤应用于临床多年，疗效显著。

本实验探讨了温肾育卵汤对PCOS模型大鼠卵巢ERα和ERβ表达的影响。与正常组比较，模型组大鼠卵巢组织中ERα、ERβ蛋白和基因表达量都呈现不同程度的下降。蛋白表达量的变化和比较通过免疫组化和Western blotting两种方式进行检测，两项检测结果具有一致性：给药后，枸橼酸氯米芬片组和温肾育卵汤低、中、高剂量组大鼠卵巢组织中ERα、ERβ蛋白表达量均有回升，其中温肾育卵汤高剂量组和枸橼酸氯米芬片组大鼠卵巢组织中ERα蛋白表达量最明显，温肾育卵汤中剂量组大鼠卵巢组织中ERβ蛋白表达量最明显。温肾育卵汤高剂量组大鼠卵巢组织中ERα、ERβ基因表达量最明显。结果表明温肾育卵汤能提高PCOS大鼠卵巢ERα、ERβ蛋白和基因表达量，改善卵巢功能，促进卵巢发育和正常排卵。

本项研究显示温肾育卵汤对PCOS模型大鼠卵巢ERα和ERβ表达量具有很好的调控作用，有助于恢复PCOS大鼠卵巢ERα、ERβ的表达，验证了温肾育卵汤的疗效，为临床推广提供了实验数据和理论依据。但此研究为基础研究，还需更进一步对此方的药理药效进行探讨，与临床疗效相互佐证。