牛磺酸对毒胡萝卜素致人神经母细胞瘤细胞凋亡的保护作用研究

王 晶，宋云飞

（辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

内质网是细胞质内由膜组成的一系列片状的囊腔和管状的腔，彼此相通形成一个隔离于细胞基质的管道系统，为细胞中的重要细胞器。内质网的功能主要在于为蛋白质的合成、转运及加工提供场所，其中粗面内质网还与记忆有关。但是当细胞遭受缺氧缺血、营养过剩或缺失、钙超载等因素时，内质网功能会受到影响，导致折叠蛋白或错误折叠蛋白增多引起内质网应激，继而引发细胞凋亡[1-2]。研究[3-5]表明，内质网应激与阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病密切相关。所以开发一些临床上常用的抗内质网应激试剂对于上述疾病的治疗有一定的意义。

牛磺酸是机体内含量最丰富的游离氨基酸之一，是中药牛黄的活性成分，具有保护视网膜、调节免疫、抗氧化、调节糖脂代谢、调节脑内渗透压等多种生理作用，并且在神经系统中牛磺酸还可充当神经递质、营养因子的作用以对抗神经兴奋毒性发挥神经保护作用[6]。罗济璇等[7]发现，牛磺酸通过下调GRP78和CHOP的表达来减轻斑马鱼脑缺血再灌注导致的损伤。成兰云等[8]也表明牛磺酸可抑制内质网应激发挥缺血再灌注肺损伤的保护作用。然而，牛磺酸是否能通过抗内质网应激作用减轻细胞凋亡达到保护神经细胞的作用尚不清楚。所以本实验利用毒胡萝卜素（TG）诱导人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）建立内质网应激应激细胞模型，观测牛磺酸对TG诱导细胞产生内质网应激的神经保护作用并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂Thapsigargin（美国Sigma公司，货号：T9033）；牛磺酸（美国Sigam公司，货号：T0625）；4-PBA（美国Sigma公司，货号：P21005）；MTT（阿拉丁试剂公司，货号：T100896）；一步法TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司，货号：KGA7061）；鼠抗GRP78（货号：66574-1-Ig）和GAPDH（货号：60004-1-Ig）抗体（美国Proteintech公司）；Caspase-3活性检测试剂盒（货号：C1115）；辣根过氧化物酶标记驴抗鼠IgG（货号：A0216）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0012）和SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）（货号：P0015）（碧云天生物技术研究所）。

1.1.2 仪器 倒置荧光生物显微镜（上海普丹公司，FM-600）；超低温离心机（广州吉迪公司，JIDI-16R）；超低温冰箱（青岛海尔公司，DW-86L578S）；多功能酶标仪（Thermo，1410101）；Western blotting电泳仪和转膜仪（Bio-Rad公司，1703811）；显影仪（美国Azure Biosystems公司，Azure C300）。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y细胞培养 将SH-SY5Y细胞（中国科学院上海细胞库）置于含有10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM/F12培养基中，并在含有5%CO2的37℃恒温培养箱中进行培养。2 d左右进行传代培养，取对数生长期的SH-SY5Y细胞进行以下实验。

1.2.2 TG诱导细胞损伤模型的制备 将SH-SY5Y细胞以106个/mL的密度接种于多聚赖氨酸（PDL）包被的96孔白底板中，每孔150 μL。将细胞分为0、1、3、5、10、30、50 μmol/L的TG组，每组6个孔，其中0为对照组。待细胞长成至80%～90%时，吸干培养基，加入含有相应浓度的TG培养基，置于细胞培养箱中培养24 h，MTT法检测各组细胞的存活率。

1.2.3 MTT法检测细胞存活情况 吸去96孔板中各组细胞的培养基，每孔加入含有终浓度0.5 mg/mL的MTT的培养基，置于细胞培养箱中进行孵育，2 h后弃去各孔细胞的上清液，每孔加入150 mL的DMSO溶液在摇床上慢摇10 min直至蓝紫色结晶全部溶解，用酶标仪在492 nm处测定各组细胞的吸光度，以对照组的存活率为100%，计算各组细胞的存活率。

1.2.4 细胞分组 将SH-SY5Y细胞以106个/mL的密度接种于PDL包被的96孔白底板中，每孔150 μL。将细胞分为对照组、TG组、TG+10 μmol/L牛磺酸组、TG+20 μmol/L牛磺酸组及TG+5 mmol/L 4-PBA阳性药组。各组药物与TG共同孵育24 h，观察牛磺酸对TG致细胞损伤的保护情况。

1.2.5 TUNEL法观测各组细胞中凋亡情况 吸去96孔板中各组细胞的培养基，加入适量的4%多聚甲醛固定20 min，1×PBS洗3次，5 min/次；加入1%Triton X-100透化10 min，1×PBS洗3次，5 min/次；加入50 μL TdT酶反应液，37℃避光反应1 h，1×PBS洗3次，5 min/次；加入50 μL Streptavidin-TRITC标记液，37℃避光反应30 min，1×PBS洗3次，5 min/次；DAPI染色液孵育切片，室温避光反应10 min；加适量抗荧光淬灭剂封片，倒置荧光显微镜下观察。

1.2.6 试剂盒检测各组细胞中Caspase-3活性 吸取各组细胞培养液，备用。用胰酶消化细胞，并收集至备用的细胞培养液中。600 g 4℃离心5 min收集细胞，小心吸除上清，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15 min。4℃20 000 g离心10～15 min，把上清转移到冰浴预冷的离心管中。按照Caspase-3活性检测试剂盒说明书步骤检测各组细胞中Caspase-3活性。

1.2.7 Western blotting法检测各组细胞中GRP78和CHOP蛋白表达 在每孔的细胞中加入蛋白裂解液和终浓度为1 mmol/L的PMSF，在冰上裂解30 min。然后将液体转移至1.5 mL离心管中，4℃条件下12 000 r/min离心15 min，取少量上清液用BCA试剂盒进行蛋白定量检测。各组蛋白调整至等浓度后，用5倍的蛋白上样缓冲液稀释，SDS-PAGE电泳分离。用320 mA恒流条件下1 h将胶上的蛋白用转移到0.22 μm PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入1∶1 000稀释的Caspase-3和GAPDH一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后，加入二抗置摇床上室温孵育1 h，采用ECL发光后胶片暗室曝光显影。用Image J软件对图像进行分析，结果以目的蛋白与内参蛋白GAPDH的光密度比值表示。

1.3 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件进行计算分析，Graphpad 5.0软件进行统计图的绘制。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析，其中两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度的TG对SH-SY5Y存活能力的影响 与对照组比较，给予1～50 μmol/L的TG能明显降低SH-SY5Y细胞的存活能力，差异有统计学意义（P＜0.01），其中给予10 μmol/L的TG能明显使SH-SY5Y细胞的存活能力处于（53.0±2.37）%的亚健康状态[10]。因此本实验选择TG剂量10 μmol/L作为致SHSY5Y细胞损伤的剂量。（见图1）

图1 不同浓度TG对SH-SY5Y存活能力的影响（±s，n=6）

2.2牛磺酸改善TG致SH-SY5Y细胞损伤的形态 对照组细胞贴壁较好，细胞结构正常，上皮样形态明显，折光性较好，细胞较健康。TG组细胞贴壁状态很差，皱缩明显，细胞个数较对照组明显减少，镜下可见部分细胞漂浮在培养基中，细胞结构不明显，呈长条状。而给予不同浓度的牛磺酸和4-PBA的细胞结构和形态较TG组明显有所改善，细胞个数也变多，贴壁较良好。（见图2）

图2 各组SH-SY5Y细胞的形态（×200）

2.3 牛磺酸提高TG损伤SH-SY5Y细胞的存活能力TG组细胞的存活率低于TG组，差异有统计学意义（P＜0.01）；经不同浓度牛磺酸干预后的TG损伤细胞存活率均高于TG组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（见表1）

表1 各组细胞的存活率、调亡率、Caspase-3活性比较（±s，n=6）

表1 各组细胞的存活率、调亡率、Caspase-3活性比较（±s，n=6）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与TG组比较，bP＜0.01，cP＜0.05

组别 存活率（%） 凋亡率（%）Caspase-3活性（mg/g）对照组TG组TG+10μmol/L牛磺酸组TG+20μmol/L牛磺酸组TG+4-PBA组100.00±2.29 49.20±4.04a 65.90±3.34b 72.10±4.19b 83.40±2.50b 5.00±0.57 20.70±5.40a 17.30±3.92c 13.40±1.29b 7.20±0.44b 5.50±0.41 15.70±1.40a 11.30±1.34b 9.66±0.83b 7.52±0.41b

2.4 牛磺酸减少TG致SH-SY5Y细胞的凋亡TG组凋亡细胞数量显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），而牛磺酸干预后TUNEL阳性细胞数量显著降低，且浓度越高，凋亡细胞数越少，与TG组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。（见图3、表1）

图3 TUNEL染色检测各组细胞凋亡情况

2.5 牛磺酸抑制TG致SH-SY5Y细胞中Caspase-3活性TG组细胞的Caspase-3活性高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；经不同浓度牛磺酸干预后的TG损伤细胞Caspase-3活性均低于TG组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（见表1）

2.6 牛磺酸抑制TG致SH-SY5Y细胞中GRP78和CHOP的蛋白表达 与对照组比较，TG组GRP78和CHOP的蛋白表达明显上升，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与TG组比较，给予不同浓度牛磺酸干预后GRP78和CHOP的蛋白表达明显降低，说明牛磺酸能够抑制TG致SH-SY5Y细胞的内质网应激的活化。（见图4、表2）

图4 各组细胞GRP78和CHOP蛋白表达情况

表2 各组细胞GRP78和CHOP蛋白表达比较（±s，n=6）

表2 各组细胞GRP78和CHOP蛋白表达比较（±s，n=6）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与TG组比较，bP＜0.01

组别 GRP78 CHOP对照组TG组TG+10 μmol/L牛磺酸组TG+20 μmol/L牛磺酸组TG+4-PBA组1.00±0.05 3.48±0.15a 2.73±0.17b 1.95±0.18b 1.27±0.26b 1.00±0.10 2.84±0.25a 2.21±0.27b 1.75±0.16b 1.11±0.11b

3 讨 论

细胞内钙离子浓度是由细胞膜上的离子通道、转运体来调节的，保证细胞内钙稳态的平衡。肌浆网/内质网中肌浆网/内质网钙ATP酶（SERCA）对钙离子的调控在起着重要作用。SERCA蛋白大部分结构朝向细胞内腔，含有钙离子和结合位点和ATP水解位点。当信号到达细胞时，钙离子从内质网中大量释放，导致胞内钙浓度过高，这时SERCA通过ATP的水解将胞浆内多余的钙离子逆浓度地转运到内质网中储存起来，从而准备下一个效应到来[9]。TG是一种非竞争性、细胞膜渗透性的SERCA介导的钙离子转运抑制剂，对SERCA的抑制，导致细胞内钙超载，引起内质网应激。在本研究中，首先采用0～50 μmol/L的TG孵育SH-SY5Y神经细胞24 h，通过细胞的存活率来筛选构建内质网应激应激细胞模型的浓度。结果表明1 μmol/L的TG就已经降低了SH-SY5Y细胞的存活能力，且TG的浓度越高，细胞的存活率越低，TG的浓度到50 μmol/L时细胞基本死亡。不仅如此，TG的浓度在1～10 μmol/L时细胞的存活率接近线性变化，其中10 μmol/L组的存活率在50%左右，说明细胞正处于亚健康状态，存活率太高或太低都不能说明药物的治疗作用[10]，所以本实验就采用了10 μmol/L的TG构建内质网应激细胞模型，评价牛磺酸对其的保护作用。

由于牛磺酸在大脑中具有多效性作用，牛磺酸被广大研究者认为是治疗神经疾病和精神疾病的潜在治疗分子。由于牛磺酸可以在中枢神经系统中起到抑制性神经调节剂的作用，因此有人提出了牛磺酸对谷氨酸诱导的神经元损伤的保护作用[11]。这一事实说明谷氨酸兴奋性毒性与脑损伤和神经退行性疾病有着密切关系[12]。与健康人比较，接受奥氮平治疗的精神分裂症患者血浆中的牛磺酸水平更高[13]。电生理数据表明，牛磺酸通过多种机制调节NMDA受体，从而抑制NMDA诱发的反应[14]。牛磺酸不仅通过与NMDA受体的直接相互作用，而且通过其在大脑中的神经调节作用，降低MK-801诱导的记忆缺陷和刻板行为。牛磺酸作为GABAA和甘氨酸受体的激动剂增强了抑制信号传导[15]。此外，牛磺酸可阻止谷氨酸诱导的膜去极化，并抑制通过L-、P/Q-、N-型电压门控钙通道的钙内流。此外，牛磺酸在记忆相关过程中的神经保护作用也已经得到了证实[16]。本研究结果发现，牛磺酸能改善TG诱导SH-SY5Y细胞损伤的形态，促进其存活，发挥神经保护作用。

当内质网应激反应出现时，细胞会启动未折叠蛋白质响应（unfolded protein response，UPR），通过清除错误折叠蛋白质或使未折叠蛋白质正确折叠，让内质网遭受的压力变小，功能得以恢复[17-18]。UPR的具体效应主要是堆积在内质网中的未折叠蛋白质或错误折叠的蛋白质作为信号，活化内质网膜上的GRP78，使GRP78与膜上效应蛋白解离，进入内质网优先与未折叠或错误折叠的蛋白质结合，使其正确折叠，让细胞适应内质网应激。但强烈持续的内质网应激反应将启动细胞的凋亡途径来清理这些“妥协的细胞”，如CHOP蛋白是内质网应激诱导产生的凋亡信号分子，是ER-stress细胞凋亡反应的直接结果[19-20]。伴随一些凋亡蛋白经过一系列级联反应通通进入细胞核内，以激活Caspase-3为最终目标导致细胞凋亡。所以本研究以GRP78和CHOP表达为内质网应激指标，探讨牛磺酸治疗神经损伤的机制。结果显示TG组细胞中GRP78和CHOP的表达较对照组明显升高，牛磺酸干预后GRP78和CHOP增强的作用被抑制。这些证据都从抑制TG损伤细胞中Caspase-3的活性来体现的。为了评价牛磺酸是否通过抑制内质网应激的活化对TG所致的SH-SY5Y细胞损伤起保护作用，本研究额外用了内质网应激的抑制剂4-PBA，结果发现4-PBA可以基本抑制内质网应激的活化，从而抑制TG诱导的神经细胞凋亡，促进细胞存活。

本研究证实了牛磺酸对TG诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用，牛磺酸能改善受损细胞的形态，提高存活能力，减少细胞凋亡，这种作用与抑制内质网应激的活化有关。但是其具体作用的分子机制尚不明确，需要进一步探讨研究。