血清浓度对皮肤源性前体细胞在生物材料上增殖生长的影响*

程 晓，王 澍，谷 苗，王 钰，何江虹*

（南通大学神经再生重点实验室，神经再生协同创新中心，南通 226001）

近年来,随着组织工程生物材料的研究不断深入,组织工程材料表面结构形貌可以引导轴突和神经细胞取向性生长,诱导干细胞向神经细胞定向分化,在神经再生中具有重要影响。在干细胞的增殖和分化中,局部微环境起到关键性作用[1]。因此建立体外干细胞在生物材料上的培养生长条件体系,对于研究干细胞在生物材料上的增殖、生长、分化等十分重要。

皮肤源性前体细胞（skin-derived precursors，SKPs）是来源于胚胎期神经嵴干细胞,具有高分裂增殖性、多分化潜能的皮肤源性神经干细胞,易获取,是一种理想的组织工程种子细胞,在神经损伤修复微环境中可发挥多重效用[2-3]。本研究通过比较不同血清浓度培养条件下,SKPs 在蝶翅和壳聚糖膜等具有表面结构形貌的生物材料上的增殖生长情况,获取SKPs在材料上培养的适宜血清条件,为进一步研究SKPs在生物材料上的生长分化奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物 新生1 d SPF 级健康SD 大鼠,雌雄不限,由南通大学实验动物中心提供。

1.2 材料与试剂 大蓝闪蝶（Morpho menelaus，W.m.）和天堂凤蝶（Papilio ulysses telegonus，P.u.t.）蝶翅购自北京雨潇传媒公司；杜尔伯科改良伊格尔培养基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DWEW）/F12 培养基、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）、胰酶、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购于Gibco 公司。细胞活性检测试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）购于R&D 公司。

1.3 生物材料的处理和制备 蝶翅材料的处理同文献[4],大蓝闪蝶（W.m.）和天堂凤蝶（P.u.t.）蝶翅分别经1 mol/L HCl 室温浸泡2 h,2 mol/L NaOH 溶液45 ℃浸泡过夜处理后,水洗至中性。75%乙醇浸泡消毒过夜,使用前以紫外照射15～30 min 灭菌,DWEW 至少浸泡1 h。

参照文献[4]制备5%壳聚糖膜,搅拌24～36 h 后加入水杨酸（salicylic acid，SA）,搅拌至无气泡,滴在经灭菌处理的24 孔板圆玻片上,覆盖不同规格（10、30、50 μm）的橡胶印章,自然风干后取下印章即制成不同规格的壳聚糖膜,以不覆盖印章的壳聚糖平膜作为对照组。

1.4 大鼠SKPs 的体外分离培养与鉴定 参照J.BIERNASKIE 等[5-6]报道的方法,取新生1 d SD 大鼠背部皮肤约2 cm2,去除皮下组织,解剖液漂洗后剪碎,加入Ⅺ型胶原酶,37 ℃消化至组织呈云雾状,加入清洗培养基终止消化；4 ℃1 200 r/min 离心5 min,弃上清,以清洗培养基重悬组织；用400 目筛网过滤,4 ℃下1 200 r/min 离心7 min 后弃上清,用含有40 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、20 ng/mL 表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、2%B27 和0.1%青霉素-链霉素混合溶液P/S 的无血清培养基重悬,以5.0×104个/mL 接种培养2 d 后更换培养皿,每3 d加入1～2 mL 含足量因子的培养基或半量换液,培养至8 d 时,当细胞球的中心部位因为营养不足开始发暗或细胞球开始贴壁时便可传代。采用免疫荧光化学染色鉴定细胞,倒置显微镜下观察并拍照。

1.5 SKPs 与生物材料共培养 将处理好的蝶翅和壳聚糖膜移入超净台,75%乙醇浸泡过夜,双蒸水漂洗材料,紫外光照消毒30 min,加入基础培养基室温过夜。将纯化传代后的P3 代SKPs 用800 r/min 离心6 min 后弃上清,加入SKPs 种植培养基,混匀后培养于蝶翅和壳聚糖膜各组材料表面。倒置显微镜下对蝶翅和壳聚糖膜各组材料表面生长的SKPs 观察、拍照。

1.6 SKPs 在生物材料表面的细胞活力检测 SKPs在蝶翅和壳聚糖膜表面培养4、24 和48 h 后,在不同时间点将10 μL CCK-8 溶液与10 μL 培养基混匀后加入SKPs-材料中,放入培养箱孵育4 h 后,吸取不同SKPs-材料的上清液100 μL/孔分别加入96孔板中,每组设3 个复孔,取出培养板,用酶标仪测量450 nm 处吸光度。

2 结 果

2.1 不同血清浓度培养条件对SKPs 在蝶翅材料上增殖生长的影响 从新生1 d 大鼠背部皮肤分离提取制备SKPs,培养24 h 后可见培养皿中有部分细胞贴壁,但大部分细胞为悬浮细胞。取上清换皿培养3 d 后可见细胞呈悬浮状生长,大部分为小型细胞团,折光性强,传代后的P3 代SKPs 经细胞免疫荧光化学染色检测,表达外胚层神经干细胞标志物Nestin、中胚层间质细胞标志物Vimentin 和Fibronectin、毛囊真皮乳头真皮鞘标志物Versican,可与生物材料共培养。

将SKPs 在具有不同表面结构形貌未包被促黏附试剂的两种蝶翅材料上培养,发现SKPs 在两种蝶翅材料表面均能黏附。CCK-8 法结果显示,在含有1%FBS 培养基条件下,两种蝶翅材料上培养4、24 h的SKPs 活力均显著低于5%和10%FBS 培养基条件（P<0.05）,5%和10%条件下细胞活力差异无统计学意义（P＞0.05）,但5%FBS 条件下细胞活力略高（图1）。培养48 h 后倒置显微镜下观察,发现1%FBS 培养基条件下,两种蝶翅材料上均可见大量细胞碎片,细胞内出现空泡,细胞趋于裂解死亡。而5%和10%FBS 培养条件下两种蝶翅材料上细胞均折光性强,轮廓清晰,可见明显细胞突起,细胞生长情况良好。同时可见5%和10%FBS 培养条件下在大蓝闪蝶（W.m.）蝶翅表面细胞突起均基本沿嵴纹方向伸展,细胞排列具有显著的方向性；在天堂凤蝶（P.u.t.）蝶翅表面细胞突起生长方向杂乱（图2）。

图1 SKPs 在蝶翅表面不同FBS 浓度条件下培养4、24 h 的细胞活力

图2 SKPs 在蝶翅表面培养48 h 细胞形态观察（Bar=20 μm）

2.2 不同血清浓度培养条件对SKPs 在壳聚糖膜材料上增殖生长的影响 仿生大蓝闪蝶蝶翅表面拓扑结构,制备表面具有平行嵴纹结构的壳聚糖膜材料,且调整嵴纹结构尺寸,制作10、30 和50 μm 3 种不同宽度,采用壳聚糖平膜为对照。通过光学显微镜和扫描电镜观察,条纹稳定并且互相平行,壳聚糖平膜表面光滑平整,无杂质。

将SKPs 在4 种具有不同表面结构形貌的壳聚糖膜材料（10、30、50 μm、平膜）上培养,材料上均不包被促黏附试剂,结果显示SKPs 在材料表面均能黏附。在含有1%FBS 培养基条件下SKPs 的活力均显著低于5%和10%FBS 培养基（图3）。培养48 h 后倒置显微镜下观察细胞形态,发现1%FBS 培养基条件下,在4 种表面形貌壳聚糖膜上,细胞突起均回缩,细胞大多呈球形,细胞成团现象增多,可见大量细胞碎片,胞内出现大量空泡,细胞趋于死亡。而5%和10%FBS 培养条件下细胞生长情况良好,呈散在分布,折光性强,轮廓清晰,出现较明显的双极或多极细胞突起,无明显细胞碎片,尤其是表面具有10 μm嵴纹的壳聚糖模组,细胞数目较1%FBS 培养条件明显增多,且细胞突起基本沿嵴纹方向伸展,细胞排列具有一定的方向性（图4）。

图3 SKPs 在壳聚糖膜表面不同FBS 浓度条件下培养4、24 和48 h 的细胞活力

图4 SKPs 在具有不同表面结构的壳聚糖膜表面培养48 h 细胞形态观察（Bar=20 μm）

3 讨 论

体外培养增殖是获得足够组织工程种子细胞的重要途径。培养基中的血清可以提供细胞增殖生长所需的因子,供给细胞培养体系中合成培养基所缺乏的营养成分,在细胞的增殖分化中发挥重要作用。但由于血清成分复杂,不同血清浓度可影响实验结果[7-8]。

根据文献[9]报道,SKPs 增殖与分化通常采用高浓度FBS（10%～15%）培养基条件。也有研究[10]报道低血清浓度培养体系能使表皮干细胞存活、快速增殖,并能很好地维持表皮干细胞的特性。本研究为探讨材料表面结构对SKPs 增殖分化影响,降低培养基中血清含量,检测低于常规血清浓度培养基条件下细胞的生长状况。

在使用经酸碱处理过的天然蝶翅作为基质材料培养细胞时,蝶翅材料上不需要包被促黏附试剂,SKPs 细胞在材料表面均能黏附。当采用不同的血清浓度培养条件时,发现在5%血清浓度条件下,细胞的增殖生长良好,与10%血清条件的细胞增殖率和生长形态相似,甚至略好；但血清浓度降至1%时,细胞增殖率显著下降,与5%和10%的血清条件相比差异有统计学意义,细胞出现崩解死亡现象,表明过低的血清浓度培养条件可能不适宜细胞在生物材料上生长。同时结果还显示,相同血清浓度培养条件下细胞的增殖差异无统计学意义,在两种不同表面形貌蝶翅材料上生长,但细胞的突起生长方向差异明显,与前期工作[4]中发现材料表面形貌对施万细胞的影响相似,表明蝶翅材料表面结构形貌可以调控多种细胞的定向运动迁移。

在仿生蝶翅表面结构制备的壳聚糖膜材料上,采用不同的血清浓度条件培养SKPs,同样可以发现,较低血清浓度（5%）可以使细胞生长良好,但血清浓度过低（1%）则细胞存活增殖生长受损,与不同表面结构的各种壳聚糖膜结果相似。

总之,本研究结果表明SKPs 在具有表面形貌的生物材料表面的增殖生长需要一定浓度的血清条件,为进一步探讨SKPs 在具有表面形貌的生物材料表面的分化所需微环境等研究提供了实验参考。