LPS通过宫颈癌细胞来源的IL-6调节巨噬细胞分泌和趋化活性

张春焕，阚士锋，魏守娟，张之杰

(1.山东大学齐鲁医院检验科，济南 250012；2.山东省妇幼保健院超声科，济南 250014)

子宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤。在全世界范围内女性肿瘤发病率和死亡率中仍排名第四[1]。晚期子宫颈癌患者的生存率并不理想,5年总生存率约60%[2]。肿瘤免疫治疗可能是治疗晚期宫颈癌极具希望的新方法。然而,由于肿瘤存在免疫逃逸机制,肿瘤局部通常处于免疫耐受和免疫低下状态[3],导致免疫治疗的有效性不如人意。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性杆菌外膜的主要糖脂成分,是目前研究最广泛的肿瘤免疫治疗佐剂之一。它与细胞表面的Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)结合,继而激活免疫活性,发挥抗肿瘤效应[4-5]。研究一般认为，LPS直接作用于免疫细胞发挥促炎、抗肿瘤作用。此外，LPS也可通过调控组织局部微环境，改变局部免疫状态。如去毒素的LPS(单磷酸脂A，MPL)作为佐剂存在于HPV预防性疫苗中，促进免疫细胞向接种局部的募集和增强免疫反应活性[6]。子宫颈癌是一种免疫敏感性肿瘤,肿瘤微环境中存在大量的免疫细胞。这提示LPS可能对子宫颈癌存在一定的治疗作用。

巨噬细胞是肿瘤局部数量最多的免疫细胞群体[7-8]。作为专职的抗原提呈细胞,巨噬细胞的主要作用是识别、吞噬抗原并将其呈递至效应T细胞,并通过分泌细胞因子等多种机制调节获得性免疫应答活性,因此在抗肿瘤免疫中发挥关键作用[9]。本研究旨在探讨LPS对子宫颈癌细胞分泌活性的影响,以及LPS在子宫颈癌细胞-巨噬细胞相互作用中的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人宫颈癌细胞系HeLa细胞和急性单核细胞白血病细胞系THP-1细胞均购自ATCC。

1.1.2 主要试剂 RPMI 1640培养液和胎牛血清均购自Gibco公司,LPS购自Sigma公司,17细胞因子检测试剂盒购自BioRad公司,ELISA试剂盒购自R&D公司,Trizol和脂质体2000购自Invitrogen公司。

1.1.3 主要仪器设备 CO2培养箱(德国Hereaus公司);超净工作台(苏州安泰公司);低温高速离心机(美国SGUVPLUS);Bio-Plex悬浮芯片检测仪和ChemiDocTMTouch成像系统(美国伯乐bio-rad公司);实时定量PCR仪(罗氏LightCycler2.0)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及THP-1来源巨噬细胞的生成 细胞用添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，置37℃、5%CO2培养箱。为了获得HeLa细胞的条件培养基(conditioned medium,CM),将2×105个HeLa细胞接种到含2mL完全培养基的6孔板。6h后,加不同浓度的LPS。洗涤培养基,用新的完全培养基继续培养12h。收集细胞上清作为HeLa条件培养基,用于以后实验。1×106个THP-1细胞用100ng/mL 佛波酯(PMA)处理48h,收集贴壁细胞用于以后的实验。在某些情况下,用PMA处理6h,用50%总体积的宫颈癌细胞CM代替培养液,并在PMA浓度维持在100ng/mL的情况下继续培养THP-1细胞42h。

1.2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) 用ELISA试剂盒检测HeLa和THP-1来源的巨噬细胞CM中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、MCP-1、TNF-α和CCL22的浓度。

1.2.3 实时定量RT-PCR 用TRIzol提取总RNA,逆转录合成cDNA,进行实时定量RT-PCR检测,采用GAPDH作为内控。用2-ΔΔCT法测定各样本的基因表达水平。

1.2.4 小干扰RNA转染 采用基因化学公司设计的针对人IL-6的小干扰RNA和干扰阴性对照,将5×105的HeLa细胞接种到24孔板的200μL无血清RPMI 1640培养基,达到60%融合。将100μL脂质体2000与IL-6 siRNA或阴性对照siRNA混合加至孔中6h。每孔再补充200μL完全培养基,继续培养48h。在某些情况下,在36h的时间点加100ng/mL的LPS,实验继续进行12h以上,以匹配未转染组的培养时间。更换1mL完全培养基继续培养12h，收集上清。人IL-6和干扰siRNA的序列分别为5'-CUUCCAAUCUGGAUCAAU-3'和5'-GGGCAAGACGAGCGGGAAG-3'。

1.2.5 迁移分析 将1×105THP-1来源的巨噬细胞重悬于100μL的无血清RPMI 1640培养基,加至Transwell小室上室(8μm孔,BD Biosciences)。下室加600μL含20%胎牛血清或宫颈癌细胞CM的RPMI 1640培养基。在5%CO2中37℃孵育24h,用甲醇固定,伊红染色。每孔随机拍摄5个视野,计数。

1.2.6 Western blot法检测 6孔板细胞用PBS洗涤,等体积含1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解缓冲液在冰上裂解,4℃ 300g离心10min,10%SDS-PAGE分离等蛋白裂解产物,转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(微孔)。在含0.1%吐温-20的TBS中用5%牛血清白蛋白室温封闭1h,用NF-κB或β-actin抗体4℃孵育过夜。二抗标记(1∶3000)1h,化学发光系统进行检测。

2 结 果

2.1 qRT-PCR和ELISA检测LPS作用HeLa细胞12h后上清细胞因子水平 qRT-PCR检测结果显示,经100ng/mL LPS处理后,IL-6 mRNA转录显著上调(图1A)。ELISA结果显示,均检测出IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IFN-γ、MCP-1及TNF-α表达,其中IL-6表达水平较高(约180pg/mL),未检测出IL-1β、IL-10和IL-12表达。表明LPS作用后,IL-6表达水平均发生显著上调,其他细胞因子表达水平未发生显著改变(图1B)。

2.2 LPS调节宫颈癌细胞对THP-1来源巨噬细胞

细胞因子分泌的影响 对照组HeLa细胞CM抑制THP-1来源巨噬细胞的促炎细胞因子分泌，包括IL-1β、IL-6,而IL-10和CCL22的转录和分泌水平均显著上调(图2A)。与之相比,LPS刺激后的HeLa细胞CM对THP-1来源巨噬细胞分泌谱的调节作用发生逆转(图2B)。

2.3 LPS促进IL-6表达而参与宫颈癌细胞对THP-1来源巨噬细胞分泌谱的调节 在THP-1向巨噬细胞诱导分化的过程中加转染IL-6 siRNA的HeLa细胞CM，并对细胞因子的mRNA和蛋白水平进行检测。如图3所示,未经LPS作用时,转染control siRNA或IL-6 siRNA的宫颈癌细胞CM对巨噬细胞的细胞因子表达均无显著差异;而当存在LPS作用时,RT-PCR和ELISA结果分别显示，IL-6 siRNA可显著抑制HeLa细胞上清对巨噬细胞促炎因子的mRNA和上清中蛋白浓度，如IL-1β和IL-6,而对IL-10和CCL22的表达无显著作用。

图1 RT-PCR和ELISA分别检测细胞因子转录和分泌水平**P<0.01 vs 对照组；★未检测到;1:IL-1b;2:IL-2;3:IL-4;4:IL-6;5:IL-8;6:IL-10;7:IL-12;8:IFN-γ；9:MCP-1;10:TNF-α

图2 有LPS(100ng/mL)作用的HeLa细胞条件培养基对THP-1来源巨噬细胞分泌谱的影响A：mRNA水平；B：蛋白水平;*P<0.05；**P<0.01CM：HeLa细胞条件培养基；CM-LPS：经LPS处理后的HeLa细胞条件培养基

图3 有LPS(100ng/mL)作用的HeLa细胞或IL-6 siRNA转染的HeLa细胞条件培养基对THP-1来源巨噬细胞分泌谱的影响A：mRNA水平；B：蛋白水平;*P<0.05；**P<0.01CM：HeLa细胞条件培养基；CM-LPS：经LPS处理后的HeLa细胞条件培养基

2.4 LPS促进宫颈癌细胞对巨噬细胞的募集作用 为探究LPS是否影响宫颈癌细胞对巨噬细胞的募集,利用Transwell小室建立体外细胞迁移模型。THP-1分化形成的巨噬细胞置于小室上层,下室为LPS作用后的宫颈癌细胞CM或对照组CM。24h后，观察迁移至小室下层的巨噬细胞数量。如图4A所示，经LPS作用的HeLa细胞CM显著促进THP-1来源巨噬细胞的迁移。

进一步探究IL-6在LPS促进宫颈癌细胞对巨噬细胞募集中的作用。与对照siRNA相比,IL-6 siRNA转染之后的HeLa细胞CM对THP-1来源巨噬细胞的募集作用被显著抑制(图4B)。

图4 LPS(100ng/mL)作用的HeLa细胞或IL-6 siRNA转染后的HeLa细胞上清对THP-1来源巨噬细胞迁移活性的影响A:LPS(100ng/mL)作用HeLa细胞上清诱导后的THP-1来源巨噬细胞迁移数;B:LPS(100ng/mL)作用HeLa细胞进行对照siRNA或IL-6 siRNA转染，细胞上清诱导下THP-1来源巨噬细胞迁移数;**P<0.01;CM:HeLa细胞条件培养基;CM-LPS:经LPS处理后的HeLa细胞条件培养基

2.5 LPS通过NF-κB通路促进宫颈癌细胞IL-6表达 LPS开始作用5min时，HeLa细胞中磷酸化NF-κB水平即出现上调，磷酸化水平在作用30min时到达高峰，提示NF-κB信号通路被激活(图5A)。利用NF-κB信号通路抑制剂PDTC(4μg/mL)预处理HeLa细胞1h，更换培养基后加LPS继续作用12h。ELISA结果显示，PDTC显著逆转LPS对IL-6分泌的促进作用(图5B)。

图5 NF-κB通路参与LPS对HeLa细胞IL-6分泌的促进作用A:PS处理对NF-κB通路磷酸化的影响；B:NF-κB信号通路抑制剂PDTC(4μg/mL)预处理后HeLa细胞IL-6分泌水平；**P<0.01

3 讨 论

LPS可有效促进系统的抗肿瘤免疫活性，可作为佐剂提高治疗性肿瘤疫苗的免疫原性，在肿瘤治疗中具有广阔的临床应用前景。然而,目前关于LPS对肿瘤局部微环境的影响及其是否影响肿瘤局部浸润的免疫细胞功能活性的问题仍所知甚少。本研究发现，LPS可通过激活NF-κB信号通路促进宫颈癌细胞分泌IL-6。细胞上清中高度表达的IL-6影响宫颈癌细胞对巨噬细胞分泌的调节作用,并促进巨噬细胞向宫颈癌细胞的募集。本研究结果提示，LPS调控宫颈癌局部微环境，并影响肿瘤细胞与肿瘤浸润巨噬细胞之间的相互作用。

HPV感染是宫颈癌的关键致病因素。在目前成熟的HPV预防性疫苗中，LPS以去毒素形式(单磷酸脂A，MPL)作为佐剂存在，以提高机体的免疫活性[10]。然而，LPS对已发生的HPV感染或子宫颈癌的免疫调节作用，目前研究较少。在小鼠模型上的研究结果显示，注射HPV16E7长肽链/LPS疫苗可有效促进CD8+T细胞等免疫细胞在移植瘤中的浸润[11]。然而，由于HPV本身存在免疫抑制效应,导致感染HPV后的宫颈上皮组织局部免疫活性缺陷，表现为促炎细胞因子表达和炎性细胞浸润数量显著低于正常组织[12-13]。本研究结果显示,宫颈癌细胞上清可抑制巨噬细胞M1型细胞因子如IL-1β及IL-6的表达,而促进M2型细胞因子如IL-10和CCL22的表达，从而使巨噬细胞呈现肿瘤支持性的M2型分泌谱。这与之前在肿瘤组织中观察到的现象一致。而经LPS作用后，宫颈癌细胞上清对巨噬细胞分泌谱的调控作用被逆转，从而提示LPS可能通过改变宫颈癌微环境，调节局部浸润巨噬细胞的功能。

IL-6是宫颈癌中特征性的细胞因子之一,在高级别宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中高表达[14-15]。由于宫颈癌细胞缺少IL-6受体的组成结构gp80[16],IL-6不能直接对肿瘤细胞产生影响，而是通过旁分泌作用影响组织中非肿瘤细胞的功能与活性[17]。本研究检测宫颈癌细胞系HeLa细胞的细胞因子表达谱,发现存在较高水平的IL-6分泌；经LPS作用后,HeLa细胞的IL-6表达迅速发生上调；通过siRNA对宫颈癌细胞IL-6表达进行抑制,宫颈癌细胞对巨噬细胞分泌的调控及对巨噬细胞的募集作用均受到抑制。既往研究发现，宫颈癌组织中高表达的IL-6促进单核/巨噬细胞[18]在肿瘤局部的聚集。结合本研究结果，IL-6可能是联系局部微环境炎症反应和肿瘤侵袭的关键分子之一。此外，本研究结果显示,LPS可促使宫颈癌细胞调控的巨噬细胞分泌IL-6，从而形成正反馈调节途径。通过这一作用机制，IL-6在宫颈癌局部发挥的作用被进一步放大,包括对肿瘤细胞生物学活性的影响，以及对肿瘤局部抗肿瘤免疫活性的调节作用。

综上所述，LPS可通过促进宫颈癌细胞IL-6的分泌,影响巨噬细胞向肿瘤的迁移和细胞因子分泌。提示LPS作为佐剂在宫颈癌治疗性肿瘤疫苗中的应用应选择适宜剂量，或采取创新性的呈递方式等措施。本研究仍存在部分问题需解决,如LPS是否通过IL-6影响巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬和抗原呈递功能?在其他类型的肿瘤中，LPS是否依然存在类似效应?后续研究中,将构建荷瘤动物模型，利用体内实验进一步对上述问题进行探究。