基于指纹图谱和化学计量法的白芥子药材质量评价研究

张泽康，喻刚艳，喻祥龙，张 晴，王昌海，赵玥瑛，白 洁*，陆 洋,2*

(1. 北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2. 深圳北京中医药大学研究院，广东 深圳 518000)

白芥子为十字花科植物白芥Sinapis albaL.的干燥成熟种子，具有温肺化痰、通络止痛等功效，主治胸胁胀痛、寒痰咳嗽、痰滞经络、关节麻木、疼痛、痰湿流注、阴疽肿毒等症[1-2]。临床常用于穴位贴敷治疗咳嗽[3]、哮喘[4-5]、慢性阻塞性肺疾病等[6]。全国各地均有栽培，主产于安徽、河南、四川、山东、浙江、陕西等地[2,7]。白芥子的化学成分主要为芥子碱硫氰酸盐、芥子酸、白芥子苷等[7]，其中，芥子碱硫氰酸盐是2020 年版《中国药典》中规定的指标性成分，也是止咳、平喘、豁痰的药效成分[8]。

2020 年版《中国药典》中芥子碱硫氰酸盐含量测定方法在实际操作中存在不足，因此本研究通过建立更为科学、合理的含量测定方法，结合指纹图谱相似度、聚类分析及主成分分析综合评价白芥子药材的质量。

1 仪器与试药

LC-20A 型高效液相色谱仪［岛津（中国）有限公司］；2998 型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；BT25 型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；AE-160 型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

芥子碱硫氰酸盐对照品（ 批号：111702-201605，纯度：98.3%）购于中国食品药品检定研究院；芥子酸对照品（批号：530-59-6，纯度≥98%）购于上海源叶生物科技有限公司。

白芥子药材（河北双宁药业有限公司，批号：0850017031），经北京中医药大学刘春生教授鉴定为十字花科植物白芥Sinapis albaL.的干燥成熟种子。

水为娃哈哈纯净水，乙腈、磷酸为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 白芥子药材中芥子碱硫氰酸盐含量测定

2.1.1 供试品溶液的制备 精密称取白芥子粉末（过3 号筛）1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，超声处理20 min（250 W，20 kHz），滤过，滤渣加甲醇同法提取3 次，滤液合并定容至150 mL容量瓶中，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.2 对照品溶液的制备 取芥子碱硫氰酸盐对照品适量，精密称定，加甲醇制成1 006 μg/mL 的对照品母液，按比例稀释得400、300、200、100、50、25 μg/mL 的对照品溶液。

2.1.3 色谱条件 LC-20A 型高效液相色谱仪［岛津（中国）有限公司］，Spursil C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm, 5 μm），以乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液（15 ∶85）为流动相等度洗脱，流速：1.0 mL/min；检测波长：326 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.1.4 芥子碱硫氰酸盐含量测定方法学考察（1）线性关系考察 取“2.1.2”项下制备的对照品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样。以峰面积Y为纵坐标，浓度X为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：Y= 34 119X- 78 982，R2= 0.999 8，结果表明芥子碱硫氰酸盐在25 ～ 400 μg/mL 内线性关系良好。

（2）精密度考察 取“2.1.2”项下制备的对照品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6 次，峰面积RSD 为0.14%，结果表明仪器精密度良好。

（3）重复性考察 按“2.1.1”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样，计算芥子碱硫氰酸盐含量，RSD 为0.12%，结果表明方法重复性良好。

（4）稳定性考察 按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样，计算芥子碱硫氰酸盐含量，RSD 为0.04%，结果表明样品24 h 内稳定性良好。

（5）加样回收率考察 取已测知含量的样品6 份，每份约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入4.40 mg 芥子碱硫氰酸盐对照品，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件进样。计算得芥子碱硫氰酸盐平均加样回收率为102.1%，RSD 为0.55%，结果表明方法稳定可靠。

2.1.5 芥子碱硫氰酸盐含量测定 测定市售三个产地15 批白芥子药材中芥子碱硫氰酸盐的含量，结果见表1。

表1 15 批白芥子药材中芥子碱硫氰酸盐含量测定结果（n = 3）Tab. 1 Determination results of sinapine thiocyanate content in 15 batches of white mustard（n = 3）

2.2 白芥子药材指纹图谱的建立

2.2.1 供试品溶液的制备 取白芥子1 g 于圆底烧瓶中，加水300 mL，回流提取30 min，待药液温度降至约50 ℃，过滤，药渣加水200 mL，同法回流一次，过滤。将两次煎液合并后用容量瓶定容至500 mL，摇匀后取5 mL 煎液，加5 mL 甲醇，室温放置10 min，于离心机中10 000 r/min 离心5 min，过0.22 μm 滤膜滤过。

2.2.2 色谱条件 2998 型高效液相色谱仪（美国沃特世公司），ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（含0.05%三乙胺溶液）（B）为流动相梯度洗脱（0 ～ 5 min，98% ～ 97% B；5 ～ 15 min，97% ～ 95% B；15 ～55 min，95% ～ 70% B），流速：1.0 mL/min；检测波长：260 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

在上述色谱条件下进行测定，白芥子药材中各成分得到很好的分离。色谱图见图1。

图1 白芥子样品 HPLC 图谱Fig. 1 HPLC of white mustard samples

2.2.3 方法学考察 （1）精密度考察 取编号P4 药材适量，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件连续进样6 次，记录峰面积，以7 号色谱峰为参照峰（S），计算得各共有峰的相对保留时间的RSD < 0.11%，相对峰面积的RSD <4.35%，结果表明仪器精密度良好。

（2）重复性考察 取编号P4 药材适量，按“2.2.1”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进样，记录峰面积，以7 号色谱峰为参照峰（S），计算得各共有峰的相对保留时间的RSD <1.05%，相对峰面积的RSD < 3.67%，结果表明方法重复性良好。

（3）稳定性考察 取编号P4 药材适量，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件分别在第0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样，记录峰面积，以7 号色谱峰为参照峰（S），计算得各共有峰的相对保留时间的RSD < 0.49%，相对峰面积的RSD < 4.76%，结果表明样品24 h内稳定性良好。

2.2.4 不同产地白芥子药材指纹图谱比较 按“2.2.1”项下方法制备15 批次白芥子药材供试品溶液，按“2.2.2”项下色谱条件进样，将图谱以cdf.格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，以P1 为参照图谱，时间窗宽度为0.1 min，对照图谱生成方法为中位数法。因P5 指纹图谱中色谱峰较少，P9 指纹图谱中杂质峰影响较大，故进行剔除处理，见图2。生成样品对照指纹图谱R，见图3。其中，13 批次不同产地白芥子药材共有峰10 个。在与对照品色谱图比对之后，确定7 号峰为芥子碱硫氰酸盐，10 号峰为芥子酸。13 批白芥子药材指纹图谱相似度范围为0.944 ～ 1.000，表明这13 批白芥子药材的指纹图谱相似度较高。

图2 15 批白芥子样品色谱峰匹配图Fig. 2 Chromatographic peak matching diagram of 15 batches of white mustard samples

图3 白芥子样品 HPLC 指纹图谱共有模式Fig. 3 The common pattern of HPLC fingerprints of white mustard samples

2.2.5 聚类分析 利用SPSS 20.0 软件对除P5、P9 外其它13 个产地的白芥子药材进行聚类分析，结果见图4。13 批白芥子药材被分为两类，P1-P4、P6 -P8、P10 号药材为一类；P11-P15 号药材为一类。聚类分析显示白芥子药材的质量受产地影响。

图4 13 批白芥子药材聚类分析图Fig. 4 Cluster analysis diagram of 13 batches of white mustard

2.2.6 主成分分析 以13 批白芥子药材的10 个共有峰的峰面积为初始数据进行主成分分析，得到主成分的特征值和方差贡献率见表2，碎石图见图5。以特征值>1 为提取标准，共确定3 个主成分，累计贡献率为85.995%，能够较好地反映其化学成分特征。对主成分载荷值进行计算，并根据公式F=0.469 12F1+ 0.279 99F2+ 0.110 84F3（F为 主 成 分综合得分，F1、F2、F3分别为3 个主成分得分）计算综合得分，见表3。不同产地白芥子综合得分为-2.51 ～ 1.20，若以10 个共有成分为综合评价指标，其中，四川产地的白芥子药材总体评分较高。主成分分析能把不同产地白芥子分开，说明其质量存在差异。

表2 主成分特征值和贡献率Tab. 2 Principal component eigenvalues and contribution rate

表3 不同产地白芥子主成分得分和综合得分Tab. 3 Principal component scores and comprehensive scores of white mustard from different producing areas

图5 13 批白芥子药材碎石图Fig. 5 Scree plot of 13 batches of white mustard

由表4 载荷矩阵可知，第1 主成分主要反映1、2、3、5、10 号色谱峰的主要信息；第2 主成分主要反映4、6、7 号色谱峰的主要信息；第3 主成分主要反映8、9 号色谱峰的主要信息。以3 个主成分为变量得到载荷图，见图6。已标定的芥子碱硫氰酸盐（峰7）落在第2 主成分，芥子酸（峰10）落在第1 主成分，且芥子碱硫氰酸盐（峰7）有较大的权重值，说明其在这13 批白芥子药材中比较稳定，对主成分的贡献率最大，在决定不同批次间白芥子药材质量差异上起着重大的作用。

图6 主成分分析载荷图Fig. 6 Principal component analysis loading plot

表4 初始因子载荷矩阵Tab. 4 Initial factor loading matrix

3 讨论

3.1 供试品的制备方法

3.1.1 粉碎粒度的考察 达到2020 年版《中国药典》粒度标准粉碎时间较长且堵塞筛孔现象严重，且2020 年版《中国药典》收载的其它种子类药材，如：莱菔子、马钱子、车前子等，均为粉碎过3 号筛后进行含量测定，因此最终确定将白芥子粉碎后过3号筛。

3.1.2 供试品复溶溶剂的考察 样品经减压回收溶剂后用流动相复溶残渣，静置后油水分离，析出白色沉淀。本研究直接以提取液定容进样，省去除去溶剂、复溶的步骤，重复性较好，且含量均符合2020 年版《中国药典》规定。

3.2 色谱条件的选择

本研究采用乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氢钾溶液（15 ∶85）进行色谱分析，相比于原流动相，大大降低了无机盐的加入量，避免高盐环境对仪器和色谱柱的损害，且能达到较好的峰型及分离效果。

3.3 分析方法评价

13 批药材指纹图谱相似度均大于 0.9，说明不同产地的白芥子药材质量较稳定。个别地区药材指纹图谱相似度小于0.9，分析原因可能与该地种植户种植年限和采收时期有关。主成分分析结果与聚类分析结果一致，15 批白芥子样品主要分为两类：四川产白芥子聚为一类，安徽产白芥子聚为一类。说明药材质量受地域影响，为白芥子的产地识别追溯提供支持。

4 结论

本研究对2020 年版《中国药典》中白芥子中芥子碱硫氰酸盐含量测定方法进行了优化，并结合指纹图谱、聚类分析和主成分分析方法对白芥子药材质量进行综合评价，结果表明白芥子药材质量和地域之间存在相关性，同时为白芥子药材质量评价研究奠定基础。