不同栽培模式茯苓药材中三萜类成分比较研究

刘常丽，胡引娣，徐 雷,2*

（1.湖北中医药大学 药学院，湖北 武汉430065；2.中国中医科学院中药资源中心，中国中医科学院博士后科研流动站，北京 100700）

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核，具有利水渗湿、健脾、宁心之功效[1]，为临床常用大宗中药材之一。2018 年国家中医药管理局发布《古代经典名方目录（第一批）》，其中包含茯苓的方剂就占四分之一，足见其配伍广泛和疗效确切[2]。茯苓的主要化学成分有三萜类、多糖类、甾醇类、蛋白质、氨基酸、脂肪酸等[3-4]，其中，三萜类化合物是茯苓的主要生物活性物质，现代药理学研究表明, 三萜类成分具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、免疫调节、治疗肾病、保肝、美白等多种药理活性，常作为评价茯苓品质的重要指标[5-6]。除药用外，茯苓也是《按照传统既是食品又是中药材物质目录》收录的药食同源药材，在食品、日化等领域亦有广泛应用。

传统茯苓以云南为道地产区，称为“云苓”，体糯质重，品质最佳，但野生资源短缺，产量不高。自人工栽培以来，湖北、安徽、河南3 省接壤的大别山区逐渐发展成为茯苓主产区[7-8]。茯苓属于木腐型真菌，主要通过菌丝体分泌胞外酶降解马尾松、赤松等植物的纤维素和半纤维素提供营养所需[9-11]。目前茯苓栽培主要采用段木方式，包括三种栽培模式：松林环境的林下仿生栽培；类似于传统农作物的旱田单作栽培；地面种植一年生浅根系草本农作物、地下种植茯苓的立体栽培。随着茯苓药材生产和松林资源保护间的矛盾日益凸显，为减少松木资源消耗，部分产区开展了代料栽培模式的探索。为评价不同栽培模式茯苓品质差异，拟采用HPLC 指纹图谱技术对茯苓药材的三萜类成分进行分析研究，以期为代料栽培模式推广应用奠定理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试新鲜茯苓菌核样品均采集自湖北省罗田县九资河镇。仿生栽培、立体栽培、旱田栽培采用成年马尾松段木，其中，仿生栽培模式为松树林下环境栽培；立体栽培模式为林边荒地地表种植芝麻，地下栽培茯苓；旱田栽培模式是在种植农作物的大田种植茯苓。代料栽培模式为人工配制培养料栽培茯苓，主要配料为松木屑、松针、玉米粒、小麦粒、熟石膏等。4 种栽培模式均采用常规田间管理技术，4 月中旬种植，10 月下旬采收。样品经湖北中医药大学药学院徐雷副教授鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核。茯苓样品共10 批，去皮后，采用趁鲜切制法加工，打粉备用，具体样品信息见表1。

表1 茯苓样品信息Tab. 1 Samples information of P. cocos

1.2 仪器与试药

Shimadzu-LC-20ADXR 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；UVmini-1240 型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；KQ-300 型超声波清洗器（武汉岱摩斯清洗设备有限公司）。

茯苓酸（批号：F-006-190813，上海创赛科技有限公司）；磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 Sigma-Aldrich公司）；水为超纯水。

1.3 试验方法

1.3.1 对照品溶液制备 取茯苓酸对照品适量，精密称定至棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容，得到质量浓度为0.1 mg/mL 的茯苓酸标准液。

1.3.2 供试品溶液制备 取茯苓药材粉末（过80目筛），精密称定约0.8 g，置于100 mL 具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 25 mL，浸泡30 min 后精密称定，超声提取60 min，冷却至室温，精密称定，补足失重，滤过，精密吸取续滤液20 mL，置于蒸发皿中，水浴蒸至约1 mL，残留物用甲醇分次溶解、洗涤，转移至5 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤液用0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得[12]。

1.3.3 色谱条件 采用Agilent Extend-C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流动相为0. 1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0 ～ 20 min，50% ～55%B；20 ～ 40 min，55% ～ 58%B；40 ～ 65 min，58% ～ 82% B；65 ～ 70 min，82% ～ 90%B；70 ～75 min，90% ～ 50%B；75 ～ 85 min，50%B），检测波长：242 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；记录时间：85 min[13-14]。

1.4 指纹图谱方法学考察

1.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6 次，记录色谱图，测得各共有峰相对保留 时 间RSD 为0 ～ 0.37%， 相 对 峰 面 积RSD 为0 ～ 4.26%，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A）”进行评价，相似度在0.985 以上，RSD为0.54%，表明仪器精密度良好。

1.4.2 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h 进样测定，记录色谱图，共有峰相对保留时间RSD 为0 ～ 0.27%，相对峰面积RSD为0 ～ 4.03%，相似度在0.950 以上，RSD 为1.52%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

1.4.3 重复性试验 取同一批茯苓药材粉末6 份，制备供试品溶液，进样分析，记录色谱图，测得各共有峰相对保留时间RSD 为0 ～ 0.50%，相对峰面积RSD 为0 ～ 4.76%，相似度在0.947 以上，RSD 为1.13%，表明所采用方法重复性较好。

2 结果与分析

2.1 茯苓 HPLC 指纹图谱建立及相似度评价

取10 批不同栽培模式的茯苓根据“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，按照“1.3.3”项下色谱条件进样分析，将色谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A）”进行分析，采用中位数法建立10 批茯苓三萜类成分的叠加指纹图谱及对照图谱（R），共标定11 个共有特征峰，结果见图1。

图1 不同栽培模式茯苓样品HPLC 叠加图谱及对照图谱（R）Fig. 1 The HPLC overlap fingerprints and reference fingerprints of P. cocos with different cultivated modes

以对照图谱为参照，进行相似度评价，10 批茯苓指纹图谱的相似度均较高，分别为0.939、0.932、0.949、0.958、0.930、0.934、0.958、0.911、0.930、0.899，表明代料栽培模式与三种段木栽培模式所生产的茯苓药材中所含主要三萜类成分相同。

2.2 不同栽培模式茯苓三萜类成分分析

在标定的11 个共有峰中， 9 号色谱峰的峰面积较大，与其相邻色谱峰的分离度亦较好，且在不同批次样品中稳定存在，故确定其为参照峰，计算其它各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，茯苓不同批次各共有峰相对保留时间的RSD 值均较小，最大也仅0.74%，结果详见表2，表明不同栽培模式生产的茯苓药材中，所含的主要三萜类化学成分种类一致。

茯苓不同批次各个共有峰的相对峰面积的RSD值均较大，RSD 值最小的是5 号色谱峰为12.72%，最大的是3 号色谱峰达112.02%，结果详见表3，显示各种三萜类成分在不同栽培模式的茯苓中含量差异较大，相同栽培模式的不同批次间相对峰面积差异较小。其中，代料栽培模式较其它三种段木栽培模式而言，1、4 号色谱峰相对面积明显较小，2、3、8 号色谱峰相对面积明显较大，表明不同栽培模式含有相似三萜类化学成分谱，但主要三萜类化学成分含量，不同栽培模式各有优势，部分以代料栽培为高，部分以段木栽培为高，部分比较接近。

表3 茯苓指纹图谱共有峰相对峰面积Tab. 3 The relative peak areas of common peaks of P. cocos fingerprints

2.3 聚类分析

选择 10 批茯苓样品的11 个共有特征峰，运用IBM SPSS（20.0）软件，采用组间连接法，度量标准选用平方欧式距离，进行系统聚类分析[15]。当分类距离d = 5 时，不同栽培模式10 批茯苓样品被分为2 类，聚类分析树状图见图2。其中，S1-S7 聚为第1 类，S8-S10 聚为第2 类，结果显示，除1 个批次旱田栽培模式样品S8 外，仿生栽培、立体栽培、旱田栽培三种段木栽培模式聚为一类，代料栽培聚为一类。表明三种段木栽培模式三萜类化学成分含量更加接近，而代料栽培模式虽含有与段木栽培相似的三萜类物质成分构成，但含量存在一定差异。

图2 茯苓样品聚类分析树状图Fig. 2 The cluster analysis tree of P. cocos samples

3 讨论

茯苓药材主要源自段木栽培，其生产需大量消耗松林资源，为减少对产区森林资源和生态环境的破坏，云南、安徽、湖北等地的部分产区已限制砍伐松林和开荒种植茯苓，因此传统段木栽培方式，已制约茯苓产业的可持续发展。尽管主产区采取森林轮伐、禁伐等措施，但持续增长的生产规模仍对道地产区松林资源保护和生态平衡产生较大威胁，代料栽培以松木屑和其它农作物及废弃秸秆为营养基质，大大降低了对成年松木资源的消耗，在保障药材质量的基础上，基于代料栽培技术的茯苓生态种植模式研究及运用，将是实现茯苓产业可持续发展的探索途径。

茯苓栽培后的腐朽木材中，纤维素、半纤维多被降解，剩下物质以木质素为主，相对含量高达50%，可作为木质素的来源，用于树脂、分散剂、表面活性剂等的制备或生产有机肥料等[10]，而在道地产区这些腐朽木材往往多被丢弃，造成较大资源浪费，给生态环境也带来压力，如何实现腐朽木材资源最有效利用也是茯苓产业发展过程中亟待解决的问题。因此，茯苓产业副产物的绿色价值还有待充分挖掘，需要基于中药资源循环理念开展药材生产过程副产物的资源化利用，以提升茯苓产业综合效益和产业竞争力，为生态环境保护及道地产区美丽乡村建设提供有力支撑[16]。

4 结论

通过对不同栽培模式茯苓HPLC 指纹图谱研究，表明代料栽培技术所生产的茯苓药材，与三种生境的段木栽培相比，含有相似的三萜类化学成分谱。进一步通过聚类分析，段木栽培模式和代料栽培模式的茯苓药材，分别聚为一类，显示两者虽然成分组成相似但含量存在差异。研究为不同栽培模式茯苓药材鉴别以及代料栽培技术推广应用提供了科学实验依据。