基于HPLC 指纹图谱的野菊花饮片及其配方颗粒质量相关性研究

余欣彤，黎桃敏，施文婷，陈伟媚，徐东婷，邝 敏，程学仁

（广东一方制药有限公司，广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244）

野菊花为菊科植物野菊Chrysanthemum indicumL.的干燥头状花序，味苦、辛，性寒，主要功效为清热解毒、泻火平肝，临床常用于治疗疔疮痈肿、目赤肿痛、头痛眩晕[1]等症。野菊花的化学成分组成复杂，含有黄酮类、萜类、挥发油类、有机酸类等化合物[2]。现代药理学研究表明，野菊花具有免疫、抗炎、神经保护、抗菌抗病毒、保护心血管系统和抗肿瘤等作用[3]。

传统经验上常以野菊花的外观性状、颜色、气味等评价其质量，2020 年版《中国药典》“野菊花”项下的含量测定成分仅限于蒙花苷，但野菊花中其它黄酮类及有机酸类成分均具有明显的药理活性[4-5]。野菊花饮片经水提、浓缩、干燥、制粒等生产工序制成配方颗粒后，其有效成分的变化情况和传递规律尚无文献报道。仅将蒙花苷含量作为野菊花质量的评价指标，难以全面反映野菊花配方颗粒的整体质量。中药指纹图谱可充分体现饮片加工制成配方颗粒整个生产过程中化学成分的改变[6-7]，实现对配方颗粒的质量控制与评价。目前，关于野菊花HPLC 指纹图谱研究主要集中在单一药材、饮片或制剂，缺乏对野菊花饮片及其配方颗粒HPLC 指纹图谱相关性的详细研究，且分析方法多局限于相似度评价[2,8-9]。本研究通过建立野菊花饮片及其配方颗粒的HPLC 指纹图谱，考察饮片及其配方颗粒质量的相关性和差异性，旨在用于野菊花配方颗粒生产过程的质量控制，也为中药配方颗粒替代传统饮片的可行性研究提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters Arc 型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；XP26 型百万分之一天平、ME204E 型万分之一天平（瑞士梅特勒—托利多公司）；Milli-Q Direct 型超纯水系统（德国Merck 公司）；B-290 型喷雾干燥仪（瑞士BUCHI 公司）；JJ2000B 型百分之一天平（常熟市双杰测试仪器厂）；TC-15 型套式恒温器（海宁市新华医疗器械厂）；YRE-501 型旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；DLSB-5/20 型低温冷却液循环水泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.2 试药与试剂

蒙 花 苷 对 照 品（ 批 号：111528-201911）、绿 原 酸 对 照 品（ 批 号：110753-202018）、 异 绿原酸A 对照品（批号：111782-201807）均购自中国食品药品检定研究院；异绿原酸C 对照品（批号：wkq20031101）、新绿原酸对照品（批号：wkq19021413）、 隐 绿 原 酸 对 照 品（ 批 号：wkq19120203）、 异 绿 原 酸B 对 照 品（ 批 号：wkq19012301）对照品均购自四川省维克奇生物科技有限公司；甲醇、磷酸、乙腈为色谱级（德国Merck公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

13 批野菊花饮片（编号：Y1-Y13）均经广东一方制药有限公司魏梅主任药师鉴定为菊科植物野菊Chrysanthemum indicumL.的干燥头状花序，野菊花配方颗粒样品（编号：S1-S13）由13 批饮片一一对应制备，饮片产地、饮片及对应配方颗粒编号见表1。

表1 样品信息表Tab. 1 Origin information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

以Waters XBridge C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）为色谱柱；以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0 ～ 16 min，5% ～ 24% A；16 ～19 min，24% ～ 29% A；19 ～ 29 min，29% ～ 30% A；29 ～ 34 min，30% ～ 32% A）；流速为1.2 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为326 nm；进样量为10 μL[10]。

2.2 对照品溶液的制备

分别取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 对照品适量，精密称定，加14%乙腈配制成混合对照品母液A；另取蒙花苷对照品适量，精密称定，加甲醇配制成对照品母液B；将对照品母液A、B 混合，摇匀，加14%乙腈定容，制成新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、蒙花苷质量浓度分别为25.32 μg/ mL、31.32 μg/ mL、25.68 μg/ mL、48.09 μg/ mL、24.23 μg/ mL、25.98 μg/ mL、49.22 μg/ mL 的混合对照品贮备液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 野菊花饮片供试品溶液 取野菊花饮片粉末（过三号筛）约0.3 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入水50 mL，加热回流45 min，过滤，滤液蒸干，残渣精密加30%甲醇100 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率：200 W，频率：50 kHz）30 min，取出，放冷，再称定重量，用30%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 野菊花配方颗粒供试品溶液 取野菊花配方颗粒适量，研细，精密称取0.3 g，置具塞锥形瓶中，精密加入30%甲醇100 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率：200 W，频率：50 kHz）30 min，取出，放冷，再称定重量，用30%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 分别精密吸取“2.2”项下混合对照品贮备液、空白溶剂、“2.3.1”项下野菊花饮片供试品溶液和“2.3.2”项下野菊花配方颗粒供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果见图1。野菊花饮片及其配方颗粒供试品色谱与对照品色谱在相同保留时间处有相应色谱峰，空白溶剂无明显干扰，表明该方法专属性良好。

图1 专属性试验HPLC 色谱图Fig. 1 HPLC chromatogram of specific test

2.4.2 精密度试验 精密吸取“2.2”项下混合对照品贮备液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，以10 号峰蒙花苷为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 值，结果均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性试验 精密称取野菊花配方颗粒（S6）适量，按“2.3.2”项下方法平行制备野菊花配方颗粒供试品溶液6 份，按“2.1”项下色谱条件测定，以10 号峰蒙花苷为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD 值，结果均小于3%，表明方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 精密称取野菊花配方颗粒（S6）适量，按“2.3.2”项下方法制备野菊花配方颗粒供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h 测定，以10 号峰蒙花苷为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值，结果均小于3%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5 图谱的分析与评价

2.5.1 指纹图谱的建立 按“2.3.1”和“2.3.2”项下方法分别制备13 批野菊花饮片及其配方颗粒供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”对色谱图进行匹配，分别得到野菊花饮片及其配方颗粒的指纹图谱共有模式，同时分别生成野菊花饮片及其配方颗粒的对照图谱，见图2-图4。野菊花饮片及其配方颗粒的指纹图谱共确定了10 个共有峰，通过与对照品对比，确定1 号峰为新绿原酸，2 号峰为绿原酸、3 号峰为隐绿原酸、6 号峰为异绿原酸B、7 号峰为异绿原酸A、8 号峰为异绿原酸C、10 号峰为蒙花苷。

图2 野菊花饮片HPLC 指纹图谱Fig. 2 HPLC fingerprint of Chrysanthemi Indici Flos pieces

图3 野菊花配方颗粒HPLC 指纹图谱Fig. 3 HPLC fingerprint of Chrysanthemi Indici Flos formula granules

图4 野菊花饮片及配方颗粒的对照指纹图谱Fig. 4 Reference map of Chrysanthemi Indici Flos pieces and formula granules

2.5.2 相似度评价 将同批次的野菊花饮片及其配方颗粒的指纹图谱进行相似度分析，结果显示同批次野菊花饮片及其配方颗粒的指纹图谱的相似度范围为0.886 ～ 0.956，表明野菊花饮片及其配方颗粒具有较好的相似性，野菊花配方颗粒的生产工艺较稳定。分别将不同批次的野菊花饮片及其配方颗粒的指纹图谱与相应的对照指纹图谱相比较，结果见表2。不同批次野菊花饮片和配方颗粒的指纹图谱与相应的对照图谱的相似度范围分别为0.968 ～ 0.999和0.867 ～ 0.999。将13 批野菊花饮片及其配方颗粒的对照指纹图谱进行相似度分析，结果见表3。野菊花饮片的10 个共有峰在野菊花配方颗粒中均有所体现，野菊花饮片及其配方颗粒的对照指纹图谱的相似度达到0.90 以上，表明野菊花饮片及其配方颗粒在化学成分种类上具有一致性，野菊花配方颗粒的质量较稳定。

表2 13 批野菊花饮片及其配方颗粒相似度结果Tab. 2 Results of similarity of 13 batches of Chrysanthemi Indici Flos pieces and formula granules

表3 野菊花饮片及其配方颗粒相似度结果Tab. 3 Results of similarity between Chrysanthemi Indici Flos pieces and formula granules

2.6 共有峰的相关性研究

不同批次野菊花饮片的HPLC 指纹图谱中各共有峰的“峰面积/取样量”值有所差异，这与不同批次野菊花饮片的质量差异有关，也进一步造成不同批次野菊花配方颗粒的HPLC 指纹图谱中各共有峰的“峰面积/取样量”值差异较大。说明为了确保野菊花配方颗粒质量的稳定性，应严格把关野菊花饮片的质量。采用SPSS 20.0 软件分别对13 批野菊花饮片及其配方颗粒的HPLC 指纹图谱中各共有峰的“峰面积/取样量”值进行双变量相关分析[11]，结果显示野菊花饮片及其配方颗粒的10 个共有峰均具有极显著正相关性，除峰4 和异绿原酸A 外，其余各共有峰的相关系数范围为0.85 ～ 0.96，其中，新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的相关系数均大于0.90。

2.7 HPLC 指纹图谱的相关性研究

采用SPSS 20.0 软件对13 批野菊花饮片及其配方颗粒各共有峰的“峰面积/取样量”值进行标准化预处理后进行主成分分析，计算得特征根和贡献率，结果见表4。第一个因子的特征根为9.076，累积方差贡献率为90.756%，表明第一个因子能基本反映全部原始变量的信息。13 批野菊花饮片及其配方颗粒的各成分因子载荷矩阵，见表5。

表4 主成分分析方差总解释Tab. 4 Principal component analysis variance total interpretation

表5 各成分因子载荷矩阵Tab. 5 Factor load matrix of each component

以提取的主成分进行综合评分计算，计算主成分1 的表达式F1，F1=α1X1+α2X2+……+αiXm（特征向量α由成分矩阵中的第i 列因子载荷q 除以特征值λ 的算术平方根所得，X为原始指标）[12]，主成分1 得分系数Ci为主成分1 的方差贡献率，得到综合评分函数F=F1× 0.907 56，野菊花饮片及其配方颗粒综合评分结果见表6。野菊花饮片及其配方颗粒的HPLC 指纹图谱的综合评分变化趋势基本一致。以13 批野菊花饮片及其配方颗粒得HPLC 指纹图谱的综合评分为变量，采用SPSS 20.0 软件对其进行双变量相关分析，相关系数为0.89（P＜0.01），表明野菊花饮片及其配方颗粒的HPLC 指纹图谱具有明显的正相关关系。

表6 13 批野菊花饮片及其配方颗粒的HPLC 指纹图谱综合评分结果Tab. 6 Results of HPLC fingerprint comprehensive score of 13 batches of Chrysanthemi Indici Flos pieces and formula granules

3 讨论

本研究分析了13 批野菊花饮片及13 批配方颗粒的HPLC 指纹图谱，从相似度结果来看，野菊花配方颗粒的10 个共有峰在野菊花饮片中均可追溯，并未出现主要化学成分的丢失，表明野菊花饮片经加工制成配方颗粒后，其主要化学成分具有一致性。同批次野菊花饮片与其配方颗粒的相似度较高，除了野菊花配方颗粒（S2）外，不同批次野菊花饮片及其配方颗粒与相应的指纹图谱的相似度均大于0.95。野菊花饮片的对照指纹图谱与野菊花配方颗粒的对照指纹图谱相比，相似度为0.912，表明野菊花饮片及其配方颗粒之间具有良好的相关性，野菊花配方颗粒可作为野菊花饮片的补充应用于临床。从野菊花饮片及其配方颗粒各共有峰“峰面积/取样量”值的双变量分析结果来看，野菊花饮片及其配方颗粒的主要化学成分具有极显著正相关关系，但13 批野菊花饮片及其配方颗粒的绿原酸类成分的相关系数具有差异性，新绿原酸、绿原酸与隐绿原酸的相关系数比异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C 的相关系数大，可能与提取过程中野菊花饮片中部分酚酸类成分发生降解和转化有关[2]。

2021 年国家药品监督管理局发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》中，指出中药材、中药饮片、中间体、中药配方颗粒特征图谱或指纹图谱应具相关性，并具有明确的量质传递规律[13]。研究结果也表明野菊花饮片及其配方颗粒的内在质量具有正相关关系。因此，应加强对原料药的质量控制，在保证中药饮片质量的前提下，更好地确保中药配方颗粒质量的稳定可控。

4 结论

本研究采用HPLC 法测定野菊花饮片及其配方颗粒的指纹图谱，测定方法具有较好的稳定性和重复性，结果准确可靠。运用化学计量学和双变量相关性分析法对指纹图谱的测定结果进行分析，可以较全面地评价野菊花饮片及其配方颗粒化学成分的质量相关性。结果显示，野菊花饮片及其配方颗粒的主要化学成分基本相同，其内在质量具有正相关关系，可为野菊花饮片及其配方颗粒的质量控制和临床应用提供依据。