唑来膦酸在白色脂肪组织棕色化中的作用

2021-11-18沈亚芳

吉林医学 2021年11期

沈亚芳，曹华

(1.南京市江宁区妇幼保健计划生育服务中心，江苏南京 211199；2.南京市江宁医院检验科，江苏南京 211199)

随着经济的发展和人们生活方式的转变，肥胖和2型糖尿病在全球范围内迅速流行，并已成为我国面临的重大公共卫生问题之一。脂肪组织是机体重要的能量储存和内分泌器官，根据功能和形态学的不同可分为白色脂肪组织和棕色脂肪组织两种类型。进一步研究发现，在冷刺激或β3肾上腺素能受体激动剂作用下，白色脂肪组织中部分脂肪细胞会转变为解偶联蛋白1(UCP1)阳性的米色脂肪细胞，其产热耗能能力虽小于经典的棕色脂肪细胞，但远远大于白色脂肪细胞，这一生物学现象称为白色脂肪棕色化。不同于白色脂肪细胞，棕色脂肪细胞和米色脂肪细胞的脂滴小而密集，线粒体内高表达UCP1，在静息状态下能够发挥强大的非战栗产热作用并消耗大量热量。目前，探寻增强棕色脂肪细胞功能和促白色脂肪棕色化的有效手段已成为治疗肥胖及其相关代谢性疾病的新策略[1]。

越来越多的证据表明，棕色脂肪组织与骨代谢间存在密切联系。骨密度与体内棕色脂肪的含量呈正相关[2]，机制研究进一步发现，脂肪组织和骨均可释放多种具有生物活性的物质实现器官间的互调，如成纤维细胞生长因子21、血管内皮生长因子、骨钙素和硬骨抑素等[3]。重要的是，脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞均起源于中胚层，这提示，作用于骨组织的药物可能对脂肪细胞存在潜在的作用。

目前，超过50%的糖尿病患者合并有骨密度减低，骨质疏松骨折已成为老年糖尿病患者致残致死的主要原因之一。唑来膦酸(Zoledronic acid，ZA)是临床上治疗骨质疏松的一线药物，它能抑制破骨细胞的功能，从而抑制骨吸收。作为糖尿病合并骨质疏松症患者常用的临床治疗药物，早期给予唑来膦酸治疗可显著预防糖尿病性骨质疏松的发生[4]。值得注意的是唑来膦酸可显著缓解肥胖小鼠的肝脏脂质沉积和脂肪变性，发挥代谢改善作用。但是，唑来膦酸是否具有调控白色脂肪棕色化的作用尚不清楚。本研究使用高脂喂养的肥胖小鼠模型和C3H10T1/2诱导分化的脂肪细胞，在动物和细胞水平探究唑来膦酸在白色脂肪棕色化中的作用。

1 材料与方法

1.1材料：C57BL/6小鼠(上海斯莱克有限公司)，唑来膦酸(美国Sigma-Aldrich公司)，RNA逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq TM(大连Takara公司)，UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16基因引物(上海英潍捷基有限公司)，高脂饲料(美国Research Diet公司)，UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16抗体(美国Abcam公司)，小动物PET/CT(德国Siemens公司)。

1.2实验方法

1.2.1动物分组：8周龄SPF级C57BL/6小鼠40只，分为普通饮食组(热量比：蛋白质26%，碳水化合物64%，脂肪10%)和高脂饮食组(热量比：蛋白质14%，碳水化合物32%，脂肪54%)，高脂喂养4周后将高脂组分为唑来膦酸干预组(HFD+ZA)和高脂对照组(HFD+PBS)，干预组腹腔注射唑来膦酸50 μg/kg，每周注射一次，正常对照组和高脂对照组腹腔注射等体积PBS，持续4周。本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2.2小动物PET/CT检查：唑来膦酸干预结束后，小鼠腹腔注射18F-氟代脱氧葡萄糖(18F-FDG，100～140 μCi)，60 min之后麻醉小鼠，采用小动物PET/CT对小鼠进行扫描并采集PET信号，同步采集CT信号用来进行PET图像的衰减校正，分析小鼠皮下白色脂肪组织(subcutaneous white adipose tissue，sWAT)18F-FDG的最大标准化摄取值(SUVmax)。

1.2.3标本采集：实验结束后处死小鼠，留取小鼠sWAT，一部分组织4%多聚甲醛固定，进行HE和免疫组化染色分析，剩余组织立即液氮冷冻后保存待测。

1.2.4HE染色:取三组小鼠sWAT样本4%多聚甲醛固定后脱水并包埋于石蜡中，在二甲苯和梯度酒精中脱蜡后使用苏木精进行核染色，而后置于伊红染液中染色后脱水、透明、封片，在光学显微镜下观察和拍照。

1.2.5免疫组化：取小鼠sWAT样本4%多聚甲醛固定后进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、染色、洗脱和封片，在200倍显微镜视野下进行观察和拍照。

1.2.6实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)：分别取三组小鼠sWAT 30 mg，置于无RNA酶的EP管中，加入1ml Trizol匀浆后，经氯仿抽提、异丙醇沉淀、乙醇洗涤和DEPC水平溶解后提取RNA。取1μg RNA逆转录成cDNA，使用cDNA模板在ABI7300型定量PCR仪检测棕色化相关基因的mRNA水平，使用β-actin作为内参基因，采用Ct比较法(2-△△CT)计算目的基因相对于内参基因的转录水平，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.7蛋白免疫印迹(Western blot)：取三组小鼠sWAT 150 mg，经蛋白裂解、离心后提取总蛋白并使用BCA法检测蛋白浓度，每个样本吸取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳后，经转膜、抗体孵育、化学发光、显影和定影后，使用Image-pro plus6.0软件对目的蛋白与内参β-actin的灰度值进行分析，以相对值进行统计学比较。

1.2.8C3H10T1/2脂肪细胞的诱导分化：C3H10T1/2细胞在培养皿中长满后加入诱导液A(正常培养液含重组人胰岛素5 μg/ml，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5 mmol/L，地塞米松1 μmol/L，吲哚美辛125 nmol/L，三碘甲酰原氨酸1 nmol/L，罗格列酮1 μmol/L)，2 d后换成诱导液B(正常培养液含重组人胰岛素5 μg/ml，三碘甲酰原氨酸1 nmol/L，罗格列酮1 μmol/L)，过2 d后换成正常培养液，待90%以上的细胞呈现圆形并出现脂滴后，表示C3H10T1/2脂肪细胞诱导成功。

2 结果

2.1唑来膦酸恢复HFD小鼠sWAT中18F-FDG 摄取水平和UCP1表达：小动物PET/CT的结果显示，与正常对照组小鼠相比，HFD组小鼠皮下脂肪的SUVmax水平明显减低，而唑来膦酸干预后小鼠sWAT的SUVmax水平显著升高。见图1。HE染色结果显示，与对照组小鼠相比，HFD组小鼠sWAT脂肪细胞的体积增大，而唑来膦酸干预后sWAT脂肪细胞的体积显著减小。见图2。进一步利用免疫组织化学染色技术对UCP1蛋白表达进行检测后发现，相较对照组小鼠，HFD组小鼠sWAT中UCP1的表达下降，而唑来膦酸干预后小鼠sWAT中UCP1的表达明显恢复。见图3。

图2 三组小鼠皮下脂肪组织HE染色形态图

图3 三组小鼠皮下脂肪组织UCP1免疫组化染色，黑色箭头指示阳性染色

2.2唑来膦酸恢复HFD小鼠sWAT中棕色化相关基因mRNA和蛋白的表达：定量PCR的结果显示，与正常对照组相比，HFD组小鼠sWAT中UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的mRNA水平显著减低(分别是对照组的0.26±0.04、0.23±0.1、0.19±0.06、0.16±0.05倍，均P<0.01)，而唑来膦酸干预后显著恢复上述基因的mRNA表达(分别是对照组的0.88±0.05、0.76±0.06、0.48±0.06、0.75±0.04倍)。见图4。Wes-tern blot结果进一步证实，相较于对照组小鼠，HFD组小鼠sWAT中UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的蛋白表达明显下调，而唑来膦酸干预可恢复上述蛋白的表达，差异有统计学意义(P<0.01)。见图5。

注：*表示与Control组相比，P<0.01；#表示与HFD+PBS组相比，P<0.01

2.3唑来膦酸上调C3H10T1/2脂肪细胞棕色化基因mRNA和蛋白表达：为探究唑来膦酸对白色脂肪棕色化的直接调控作用，C3H10T1/2脂肪细胞使用唑来膦酸(100 nmol/l)处理48 h后，检测棕色化相关基因的mRNA和蛋白水平表达。定量PCR结果显示，UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的mRNA表达在唑来膦酸处理后均显著升高，差异有统计学意义(分别是对照组的4.26±0.98、3.01±0.16、2.44±0.28、1.95±0.29倍，均P<0.01)。见图6。Western blot结果进一步发现，唑来膦酸处理后显著上调UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的蛋白水平。见图7。

注：*表示与Control组相比，P<0.01；#表示与HFD+PBS组相比，P<0.01。

3 讨论

18F-FDG是一种葡萄糖类似物，可被代谢旺盛的器官摄取，使用小动物PET/CT可检测18F-FDG在体内的分布情况，是评估棕色脂肪功能和白色脂肪棕色化的有力手段。本研究采用PET/CT分析小鼠皮下脂肪的18F-FDG摄取水平，发现唑来膦酸处理后小鼠皮下脂肪代谢活动显著增强，对18F-FDG摄取增加，免疫组化染色进一步发现皮下脂肪组织UCP1的表达升高。CIDEA、PGC1-α和PRDM16是白色脂肪棕色化中的关键转录因子和调控因子，笔者对棕色化相关基因的转录和蛋白水平分析后，发现唑来膦酸可明显上调皮下脂肪中棕色化相关基因的表达。这些证据说明，唑来膦酸具有促白色脂肪棕色化的作用。

注：*表示与Control组相比，P<0.01；#表示与HFD+PBS组相比，P<0.01图5 UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16在三组小鼠皮下脂肪组织中的蛋白表达水平

注：*表示与Control组相比，P<0.01图6 C3H10T1/2脂肪细胞经唑来膦酸(100 nmol/L)处理后，UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的mRNA相对表达水平

唑来膦酸作为一种双磷酸盐类药物，其靶点主要为法尼基焦磷酸合成酶，持续作用于破骨细胞[5]，除外作用于破骨细胞，体外研究还发现，双磷酸盐类药物还可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化并抑制其成脂分化[6]，提示其药理作用的复杂性。既往研究证实，骨细胞分泌的骨形态发生蛋白7和骨硬化蛋白具有促白色脂肪棕色化的作用，成骨细胞来源的神经肽Y同样参与了白色脂肪棕色化的调节[7]。本研究中唑来膦酸促白色脂肪棕色化是否依赖于骨细胞和成骨细胞分泌的生物活性物质值得进一步探索。笔者的细胞水平研究发现，脂肪细胞经唑来膦酸处理后棕色化相关基因的表达显示升高，这提示唑来膦酸具有促白色脂肪棕色化的直接调控作用，但其中的具体机制仍有待进一步阐明。