IL-17对大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响

刘文静，李元芹，李 静，张毛为，陈 碧

(徐州医科大学附属医院呼吸与危重症医学科，江苏 徐州 221000)

目前临床上相当多的支气管哮喘患者对糖皮质激素抗炎治疗反应差，表现出不同程度的不可逆气流受限，导致病情持续恶化。目前认为，气道重塑(airway remodeling)是引起不可逆性气流受限和难治性哮喘的病理基础，其中ASMCs的过度增殖是气道重塑的结构基础和中心性环节[1]。目前ASMCs已成为哮喘气道重塑研究及治疗的重要标靶。

IL-17是一种强大的前炎性因子，它通过诱导细胞因子和趋化因子的产生，介导局部或全身炎性反应。越来越多的证据表明，IL-17与支气管哮喘尤其是重症哮喘的发病关系密切[2-3]，能够诱发多种炎性因子的释放，促进气道炎性反应[4]。但目前对于IL-17参与气道重构的机制研究较少。近来等研究发现，IL-17能够诱导人ASMC表达生长相关性癌基因(GRO)的表达或激活ERK信号转导途径促进ASMCs的迁移，参与哮喘气道重塑[5]。本研究旨在探讨IL-17对于ASMCs增殖的影响及其可能的信号调节机制。

1 资料与方法

1.1材料：IL-17(北京中杉公司);四甲基偶氮唑盐(北京中杉公司)；兔抗大鼠ERK1/2、兔抗大鼠磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)抗体(碧云天生物科技研究所)；U0126(碧云天生物科技研究所)；羊抗兔二抗、兔抗鼠α平滑肌肌动蛋白(SM-α-actin)抗体、磷酸盐缓冲液(PBS)、D-Hanks缓冲溶液(北京中杉金桥)。DMEM细胞培养液、胰酶(美国GIBCO公司)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物有限公司)。

1.2大鼠ASMCs的体外培养：腹腔麻醉并处死大鼠，无菌摘取气管，参照文献利用组织块贴壁法进行原代细胞培养[6]。胰酶消化法进行ASMCs传代通并自然纯化，采用第5～6代细胞用于实验。本研究遵循的程序符合徐州医科大学附属医院伦理委员会所制定的伦理学标准，得到该委员会批准。

1.3大鼠ASMCs的鉴定：倒置光学相差显微镜观察传代后的ASMCs大小、形状、排列和生长等形态学特征。利用细胞荧光免疫组织化学染色测定SM-α-actin的表达，具体过程如下：将第5代的大鼠ASMCs以1×105/ml细胞密度种于6孔板内，制备细胞爬片，用4%多聚甲醛固定20 min，加入Triton-X100作用10 min透膜。常规免疫荧光染色，一抗为兔抗鼠SM-α-actin抗体，一抗4℃过夜后滴加生物素化二抗，37℃孵育30min。滴加SABC-FITC，37℃孵育30 min。利用荧光显微镜观察结果。

1.4四甲基偶氮唑盐(MTT)微量比色法测定ASMCs增殖：将传代后的ASMCs按1×104/孔接种于96孔板中培养24 h，换无血清培养液继续培养24 h同步化，换用含1%胎牛血清的培养液，随机分为五组，每组6个复孔。①空白对照组：每孔加入DMEM 100 μl；②IL-17 1 ng/ml组；③IL-17 10 ng/ml组；④IL-17 100 ng/ml组；⑤U0126组(IL-17阻滞剂组)。将药物处理过的细胞，置培养箱内培养不同时间(24 h、48 h、72 h)后，每孔加入MTT 50 μl孵育4 h，弃上清液后每孔加DMSO 150 μl，微型振荡器混匀10 min。在波长490 nm处，检测各孔OD值。根据公式计算各组细胞的生长抑制率：细胞生长抑制率=(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值×100%。

1.5Western blot测定ERK1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白的表达：将大鼠ASMC以5×105/L的细胞密度接种培养皿中培养。细胞密度接近70%时，更换无血清培养基继续培养24 h，使细胞同步化于G0期。按以下分组对细胞给予相应处理：①对照组；②IL-17 1 ng/ml组；③IL-17 10 ng/ml组；④IL-17 100 ng/ml组；⑤阻滞剂组，分别于培养箱培养2 h。收集细胞提取蛋白、SDS-PAGE电泳，转膜后杂交，以NBT/BCIP显色。一抗为兔抗鼠ERK1/2抗体、兔抗鼠p-ERK1/2抗体；条带灰度分析用Image J软件分析系统分析总ERK1/2蛋白、p-ERK1/2和内参β-肌动蛋白(β-actin)吸光度值(A值)，以目的蛋白条带A值和内参β-actin A值的比值代其相对含量。

2 结果

2.1ASMCs鉴定：在倒置相差显微镜下观察培养的细胞呈梭形，贴壁平行生长，束状排列，密集与稀疏处相互交错呈峰谷状，为ASMC的典型特征。免疫荧光染色法表明，超过95%的细胞胞质内可见大量的绿色荧光，为SM-α-actin阳性染色，证实所培养细胞为ASMCs。见图1。

A.倒置显微镜下的细胞呈“峰谷状”(×100)

B.免疫荧光显微镜下ASMCs发绿色荧光(×400)

2.2IL-17对ASMCs增殖的影响：观察不同浓度梯度的IL-17在分别培养24 h、48 h和72 h时对ASMCs增殖率的影响。随着IL-17浓度的增加，ASMCs增殖率也随之增加，0.1～1 ng/ml IL-17在24 h、48 h和72 h内均可促进ASMCs的增值，其中以48 h内作用最为明显，24 h内作用较平缓，而72 h的作用则随着细胞状态的老化而变化不明显。另外可以看出在浓度>1 ng/ml之后细胞增殖的趋势可能为进入平台期。见图2。

图2 MTT法检测不同浓度梯度IL-17作用不同时间对气道平滑肌细胞的促增殖作用

2.3IL-17对ERK1/2磷酸化的作用：其中1 ng/ml、10 ng/ml均能促进p-ERK1/2的表达，而100 ng/ml因浓度过高反而导致细胞死亡增加，ERK1/2的磷酸化降低。加入IL-17的阻滞剂则能拮抗其对ERK1/2的促磷酸化作用。而总ERK1/2无变化。见图3。

(a)为不同浓度IL-17及其阻断剂对p-ERK1/2的作用；(b)为对不同浓度IL-17及其阻断剂对p-ERK1/2作用的分析；与对照组比较，①P<0.05；②P<0.05图3 p-ERK1/2在不同浓度的IL-17及其阻断剂作用下的表达

3 讨论

哮喘气道重塑主要表现为上皮细胞黏液性化生、ASMCs的增生和肥大、基底膜增厚及上皮下纤维化、血管形成的增加、ECM的沉积等[1]。ASMCs是参与气道重塑的关键细胞，其过度增殖、肥大不仅增加了影响气道管径的收缩力，而且导致管壁增厚，引起气道狭窄。因此，探寻促进ASMCs增殖的作用因素、抑制ASMCs的增殖对于控制重症哮喘、难治性哮喘具有非常重要的意义。

作为Th17细胞最主要的效应分子，近年来IL-17在哮喘发病中的作用逐渐受到重视。体外研究证实，IL-17能够刺激上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞分泌IL-6、IL-8,IL-11,GM-CSF,VEGF等一系列炎性因子和细胞因子，促进气道炎性细胞的募集、增殖和活化[2-3]。IL-17受体缺陷的小鼠接受致敏原刺激后，中性粒细胞和嗜酸粒细胞向气道募集被抑制，气道炎性反应减轻[7-9]。此外，IL-17可以特异性激活黏液蛋白MUC5AC和MUC5B基因，参与气道黏液高分泌的形成。但目前对于IL-17与气道重塑研究较少[10]。

近年来有学者对于IL-17与ASMCs增殖的关系做了初步研究，但结果并不一致。有学者研究发现，Th17细胞数量与哮喘小鼠的黏液分泌、上皮下胶原沉积、气道壁厚度程正相关[11]。给予anti-IL-17 mAb 干预后可以明显减轻OVA诱导的气道平滑肌增厚、肺组织胶原沉积。他们进一步研究发现，Th17 cells 在体外并不能直接促进ASMCs的增殖，而是通刺激气道上皮细胞分泌HB-EGF，间接促进ASMCs的增殖。而也有学者研究[10]发现，IL-17A在体外能够直接促进人ASMCs的增殖，应用IL-17A单克隆抗体中和IL-17后其促ASMCs增殖作用被抑制。本研究利用应用IL-17干预体外培养的大鼠ASMCs，结果显示大鼠ASMCs增殖率较对照组增加，提示IL-17能够直接促进ASMC的增殖,参与气道重塑。本研究在MTT试验在0.1～1 ng/ml做了浓度梯度研究，结果显示在此浓度范围间随着IL-17浓度的增加，ASMCs增殖率也随之增加，浓度大于1 ng/ml之后细胞增殖的趋势已进入平台期。而在时间点上，本研究发现以48 h内促增殖作用最为明显，而72 h的作用则随着细胞状态的老化而变化不明显。

细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)信号通路是把细胞外信号转导到核内调控基因表达的重要细胞内信号分子，是多数生长因子和炎性介质调控ASMCs增殖的共同通路。ERK是该通道中的关键酶，已发现它在气道平滑肌上广泛分布，主要为ERK1、ERK2(ERK1/2)两种亚型。在体外培养的人气道平滑肌细胞中研究发现，IL-17能够激活ERK信号转导途径促进ASMCs的迁移[12]。本研究中Western blot结果显示，IL-17干预后ASMC p-ERK1/2的表达较对照组明显增加，而总ERK1/2无变化。而加入ERK1/2抑制剂后IL-17组对大鼠ASMC促增殖作用被抑制，表明IL-17能够通过激活ERK1/2信号通路促进ASMC的增殖。

综上所述，IL-17能够促进大鼠ASMC的增殖，可能与激活ERK1/2信号通路有关。本研究结果为阐明IL-17参与哮喘气道重塑的机制提供了新的依据，为以后临床以IL-17为靶点治疗哮喘提供了理论依据。