绵羊脂肪细胞分化过程Wnt/β-catenin 信号通路关键基因变化的研究

肖 成，王 晶,2，薛佳佳,3，柳俭强，于永生，张立春，马惠海，金海国*，曹 阳*

（1.吉林省农业科学院，吉林公主岭 136100；2.延边大学农学院，吉林延吉 133000；3.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130000）

优质羊肉越来越受到消费者的欢迎，而提高肌内脂肪含量能够提升羊肉品质。遗传因素是影响肌内脂肪含量的重要因素之一，但参与调控绵羊脂肪细胞分化过程的基因及通路错综复杂。本文着重研究Wnt/β-catenin信号通路关键基因在绵羊脂肪细胞分化过程中的变化规律。这为研究参与绵羊脂代谢并与Wnt/β-catenin 信号通路相关的作用基因提供有价值的参考。Wnt 信号通路能够调节个体生长，参与机体多方面发育，是维持器官稳态的著名信号通路。目前，科研人员研究Wnt/β-catenin 信号通路主要围绕细胞增殖、肿瘤、疾病、神经、繁殖等方面进行[1]。近年来有研究发现，Wnt/β-catenin 参与脂肪细胞分化，发挥重要作用[2]。目前，在人、小鼠、猪以及牛上关于Wnt/β-catenin 信号通路的研究较多[3]，但在绵羊上，Wnt/β-catenin 信号通路关键基因如何变化仍没有系统研究。因此，本实验以此为切入点，探索Wnt/β-catenin 信号通路关键基因在绵羊脂肪细胞分化过程中的变化规律，旨在为Wnt/β-catenin信号通路在绵羊脂代谢方面的研究提供有价值参考，为寻找与绵羊脂代谢相关的作用基因提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验选择2 月龄雄性绵羊1 只，由吉林省农业科学院动物生物技术研究所饲养。人道处死后，无菌取腹沟处白色脂肪组织，用于分离前体脂肪细胞。

1.2 实验材料 分离细胞所用胰酶、胶原酶II 来自Sigma 生物公司；细胞培养皿来自Corning 公司；胎牛血清来自Gemini 生物公司；PBS 缓冲液、DMEM-F12培养基、双抗来自赛默飞生物公司；细胞分化诱导剂如（胰岛素、地塞米松、IBMX）等均来自Sigma 公司；RNA 提取试剂TRIzol 来自Invitrogen 公司；PCR 预混酶来自康为世纪生物公司；反转录试剂盒、DL2000 Maker 购自TaKaRa 生物有限公司；PCR 引物及测序服务由苏州金唯智生物科技有限公司提供；LightCycler 480 SYBR Green I Master 由罗氏（中国）公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 绵羊前体脂肪细胞分离 用含有1%双抗的PBS 清洗干净白色脂肪组织，无菌镊子剔除脂肪组织中筋膜及血块，手术剪刀将组织剪成1 mm3小块。组织块用胶原酶II 浸泡并置于37℃水浴锅内消化1 h，每5 min 混匀一次，消化后液体经200 目及400 目滤网过滤出未消化的组织及杂细胞。1 500 r/min 转离心15 min 弃上清。完全培养液重悬细胞并接种到60 mm 培养皿中，细胞大约6 h 贴壁。12 h 换液，除掉杂细胞及未贴壁细胞。细胞置于37℃、5% CO2浓度培养箱培养，每48 h 换液，待细胞长满培养皿。胰蛋白酶消化细胞，传代培养。第三代细胞进行体外诱导，胰岛素、地塞米松以及IBMX混合培养液作为诱导I 液诱导细胞，48 h 换诱导II 液（含胰岛素的完全培养基），48 h 后换完全培养基。细胞继续培养5 d，油红O 染色验证成熟的脂肪细胞。

1.3.2 引物设计及验证 根据Genbank 中提供的绵羊基因Wnt/β-catenin 信号通路关键基因序列以及内参基因GAPDH序 列（NM_001190390.1），使 用Primer 5 软件设计相关基因实时荧光定量PCR 引物序列（表1）。定量引物验证，使用普通PCR 方法检测引物特异性。PCR 反应体系20 μL：预混酶10 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL、模板 1 μL、ddH2O 8 μL；扩增条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s、退火温度30 s、72℃延伸温度30 s、35 个循环，72℃延伸8 min，4℃保存。产物经琼脂糖凝胶电泳实验，条带单一引物可用于定量实验。

表1 Wnt/β-catenin 信号通路关键基因引物序列

1.3.3 提取细胞分化过程中不同时间点RNA 前体脂肪细胞分化过程包含2 个阶段，第一个阶段是细胞增殖，当细胞布满培养皿后细胞进入第二阶段，即细胞分化。体外细胞分化为成熟的脂肪细胞需要诱导剂的参与。实验从细胞整个分化过程中选择4 个关键时间点用于验证Wnt/β-catenin 信号通路关键基因变化规律。它们分别是：①细胞布满培养皿时期，即细胞增殖期（第2天）；②细胞添加外源诱导I 液48 h 后，即细胞开始进入分化期（第4 天）；③细胞添加外源诱导II 液48 h后即细胞分化期中期（第6 天）；④细胞更换正常培养液48 h 后，即细胞分化期（第8 天）；采用TRIzol 试剂提取上述4 个时间点细胞总RNA，并反转录为cDNA。

1.3.4 实时荧光定量PCR 定量PCR 采用罗氏480 仪器以及配套试剂，qRT-PCR 体系为20 μL：Light Cycler 480 SYBR GreenI Master（2×）10 μL、ddH2O 8 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL。反应程序：95℃5 min，95℃ 10 s、60℃ 15 s、72℃ 20 s，共40 个循环，95℃ 5 s、65℃ 1 min、40℃ 10 s，每组实验重复3 次。Roche Light Cycler 480 软件进行数据分析。

1.4 数据分析 每组实验重复3 次，数据以“平均值±标准差”表示，采用GraphPad Prism 软件作图，利用SPSS 17.0 软件对数据进行单因素方差分析，显著性水平定为P<0.05，极显著水平定为P<0.01。

2 结果

2.1 绵羊前体脂肪细胞分离、培养、诱导、分化 前体脂肪细胞接种到培养皿后，显微镜下观察细胞为呈球状。通过细胞计数仪检测其直径大小约为10～30 μmol/L。细胞接种6 h 后开始贴壁，其形态呈不规则梭形。12 h换液去除未贴壁细胞，此时细胞开始进入快速增殖阶段。当细胞布满培养皿后出现生长抑制。添加外源诱导剂，细胞开始进入分化阶段。当细胞分化一定阶段后，内部有脂滴生成，经油红O 染色，可以将脂滴染成红色，验证脂肪细胞诱导成功（图1）。

图1 油红O 染色脂肪细胞图

2.2 提取细胞总RNA 并验证引物 实验选择细胞分化过程的第2 天、第4 天、第6 天、第8 天，共4 个时间点提取细胞总RNA，经琼脂糖凝胶电泳实验以及分光光度计检测，发现RNA 纯度以及浓度均达到实验要求可以进行后续实验。由图2 可知，引物特异性好，可以用于实时荧光定量PCR 检测。

图2 定量引物琼脂糖凝胶电泳图

2.3 实时荧光定量PCR 以上述总RNA 为模板反转录成cDNA 分别检测Wnt10b、Frizzled1、Frizzled2、GSK3β、LRP5、LRP6、β-catenin基因在脂肪分化过程中的表达规律。如图3 所示，Wnt10b、Frizzled1、GSK3β、LRP5、LRP6基因表达量在第4 天显著上升，然后出现显著下降。Frizzled2基因在第4 天以及第8 天显著下降。β-catenin基因只有在第8 天出现显著上升。

图3 实时荧光定量PCR 检测基因相对表达

3 讨 论

Wnt 蛋白是含有350～400 个氨基酸的分泌型糖蛋白，人类基因组中已发现有19 种Wnt 蛋白[4]。Wnt 蛋白调控多条信号通路，其中Wnt/β-catenin 信号通路是经典的Wnt 信号通路之一，最近有研究发现Wnt/β-catenin 信号通路在脂肪细胞形成过程中发挥重要作用，其中β-catenin作为第二信使具有重要的调节功能[5-6]。有研究表明，在生理条件下Wnt/β-catenin 信号通路是不活化的，保持较低的表达水平。细胞内GSK3β基因不断磷酸化导致β-catenin基因不能发挥作用[7]。当外界信号刺激Wnt 蛋白，Wnt 活化转移到细胞膜上结合细胞表面特异性受体卷曲蛋白Frizzled 并与低密度脂蛋白LRP5/6形成复合体抑制GSK3β基因表达，解除GSK3β基因对β-catenin的限制。细胞内的β-catenin不断积累并进入细胞核与靶基因结合发挥作用[8-15]。有研究表明，Wnt10b基因在小鼠前体脂肪细胞增殖过程中高表达，添加成脂诱导剂后，其表达量减少，Wnt10b基因具有抑制脂肪细胞分化的能力[5,16]。因此本实验选择检测Wnt/β-catenin 信号通路关键基因Wnt10b、Frizzled1、Frizzled2、GSK3β、LRP5、LRP6、β-catenin。

在本次实验中发现，Wnt10b、Frizzled1、GSK3β、LRP5、LRP6基因在第4 天显著上升，然后显著下降。Wnt10b、Frizzled1、LRP5、LRP6在绵羊细胞增殖融合时以及添加外源诱导I 液时显著表达。随着分化的进行，其基因相对表达量显著下降。实验结果与Ross[5]的研究结果一致。这说明Wnt10b可能结合受体Frizzled1、LRP5、LRP6基因在绵羊脂肪细胞增殖过程高表达发挥作用，促进前体脂肪细胞增殖，同时抑制脂肪细胞分化。当细胞开始分化时Wnt10b表达被减弱，其受体Frizzled1、LRP5、LRP6基因表达也开始降低。稍有差别的是Wnt10b、Frizzled1、LRP5、LRP6、GSK3β基因只有在绵羊细胞快速增殖及添加诱导I 液时短时间高表达，这是与小鼠不同的地方。可能是因为在绵羊个体中Wnt其他成员参与此过程，表达时间不同。Frizzled2基因在第2 天以及第6 天显著升高，在第4天以及第8 天显著下降。可能是由于Frizzled2基因对细胞增殖具有一定的促进作用，但是随着诱导I 液的加入，一些促进细胞分化的因子开始表达如PPARγ、C/EBPα，导致Frizzled2基因被抑制。这可能说明在绵羊脂肪细胞分化过程中，Frizzled2基因不与Wnt10b基因结合，相反可能受其抑制。随着Wnt10b基因表达量下降，Frizzled2基因表达量出现短暂上升，随后由于具有抑制脂肪分化的功能，所以表达量又出现下降。β-catenin基因前6 天的趋势与Wnt10b基因一致，只有在第8 天出现上升，可能是由于具有其他功能而导致的，具体机制需要进一步研究。

4 结 论

绵羊脂肪细胞分化过程中Wnt/β-catenin 信号通路发挥重要作用。其中关键基因Wnt10b、Frizzled1、Frizzled2、GSK3β、LRP5、LRP6、β-catenin均出现显著变化。Wnt10b、GSK3β、Frizzled1、LRP5、LRP6基因在第4 天出现显著升高，Frizzled2、β-catenin基因出现不同的变化趋势，具体机制需要进一步研究。