基于全基因组重测序对不同鸭遗传资源进行群体结构分析

2021-11-18王统苗郭其新常国斌陈国宏

中国畜牧杂志 2021年11期

王统苗，郭其新，白皓,3，常国斌，陈国宏*

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.靖江市农业农村局，江苏泰州 214500；3.扬州大学农业科技发展研究院，教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏扬州 225009）

我国鸭产业发展历史悠久，鸭遗传资源丰富。然而，随着社会经济的快速发展、人口居住地的迁移和生态环境的变化，鸭种质资源的丢失也在加快[1]。研究鸭遗传资源群体结构，可以为鸭遗传资源保种工作提供科学有效的数据。高通量测序技术的出现及迅速发展可以更快速、有效取得大量的生物遗传变异信息[2]。

基于全基因组重测序的群体遗传进化分析是通过测序手段和生物信息分析技术相结合来探讨生物群体的遗传结构，为育种、进化等研究工作提供了理论基础。陈彬龙[3]利用全基因组重测序技术对不同地理位置的藏鸡的群体结构进行了分析，系统发育进化树和主成分分析（PCA）结果显示，6 个具有地理代表性的藏鸡群体至少存在3 个明显的分支，这些独特的分布模式显示藏鸡可能与其他家鸡一样是多起源的；章双杰等[4]利用全基因组测序技术对娄门鸭、昆山麻鸭、巢湖鸭和高邮鸭进行遗传多样性分析，通过群体系统进化树分析和CNV 交集分析发现娄门鸭和昆山麻鸭为一类，巢湖鸭和高邮鸭为一类；Haile[5]利用全基因组重测序对埃塞俄比亚和中国山羊群体的群体结构进行分析，通过系统发育分析将山羊品种按照其起源地分成了4 个分支。本研究基于全基因组重测序，利用主成分分析、群体结构分析、系统发育树分析研究了我国部分地方鸭遗传资源的群体结构，旨在为地方鸭遗传资源开发利用和保种提供科学有效的数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取国家级水禽基因库（福建）鸭遗传资源缙云麻鸭、中山麻鸭、山麻鸭、金定鸭、麻旺鸭、台湾褐色菜鸭、连城白鸭、龙胜翠鸭、莆田黑鸭、莆田白鸭、攸县麻鸭、三穗鸭、吉安红毛鸭、绍兴鸭和巢湖鸭300 日龄公母鸭各10 只，其遗传资源基本信息如表1 所示，翅静脉采血约3 mL 置于含有EDTA 抗凝剂的采血管中，混合均匀之后-20℃保存，用于后续实验。

表1 本研究所用鸭遗传资源的基本信息

1.2 全基因组重测序

1.2.1 文库构建文库构建流程如图1，检验合格的DNA 样品被Covaris 超声波破碎仪随机打断成350 bp长度的片段。DNA 片段经末端修复、添加ployA、添加测序接头、纯化、PCR 扩增等步骤完成整个文库制备。所构建的文库通过Illumina 测序仪进行测序。构建完文库后，先使用Qubit 2.0 进行初步定量，将文库稀释至1 ng/μL，随后使用Agilent 2100 检测文库的插入片段大小，一旦插入片段大小符合预期，使用Q-PCR 确定文库的有效浓度，准确定量以确保文库质量（有效文库浓度>2 nM）。

图1 文库构建流程

1.2.2 PCA PCA 是一种纯数学的操作方法，它允许通过对相关变量进行线性转换来选出较少个数的重要变量，实现了使用少量变量就可以对复杂的样本数据进行分类[6]。在遗传学当中，PCA 主要用于聚类分析以对不同群体进行分类。

1.2.3 构建系统发育树使用MEGA 软件包、邻近法（Neighbor-Joining Methods）构建系统发育树。邻近法是依据最小进化原理，在20 世纪90 年代提出的一种有效的系统发育树构建方法[7]，bootstrap 运行1 000 次。

1.2.4 群体结构分析群体结构分析能够对系统发育进化树、PCA 分析的群体关系结果进行验证，使用Admixture 软件进行群体结构的计算，每个K 值重复5次，计算完成后使用pophelper 软件计算∆K 值并对多次重复的结果进行合并，根据∆K 确定最优K 值，合并后的结果使用barplot 展示其群体结构组成。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA 检测结果检测所有基因组DNA 样品的质量、浓度和纯度，以满足全基因组重测序的要求。首先，琼脂糖凝胶电泳用于分析DNA 降解程度和RNA污染的程度；其次，Nanodrop 检测DNA 的纯度（OD260/280比值）；最后，Qubit 准确定量OD 值在1.8 和2.0 之间的DNA 浓度，用超过1.5 μg 以上的DNA 样品构建文库。本研究对提取的样本DNA 浓度和纯度检测结果表明，所有DNA 均符合样品重测序的要求，可以进行后续实验。基因组DNA 检测结果见图2。

图2 金定鸭基因组DNA 1%琼脂糖凝胶电泳结果

2.2 群体结构分析

2.2.1 PCA 分析 PCA 分析结果如图3 所示，可见15个鸭遗传资源分为7 个集簇，莆田白鸭、褐色菜鸭、连城白鸭和龙胜翠鸭都单独聚为一类，中山麻鸭和巢湖鸭聚为一类，距离较近；吉安红毛鸭、三穗鸭和绍兴鸭聚为一类；金定鸭、麻旺鸭、山麻鸭、攸县麻鸭聚为一类，莆田黑鸭和缙云麻鸭聚为一类，遗传距离较近。

图3 PCA 分析

2.2.2 系统进化树分析如图4 所示，15 个鸭遗传资源除了中山麻鸭其中一个个体和巢湖鸭聚为一类，其他13 个品种均独立分成一类。其中褐色菜鸭单独聚为一类；攸县麻鸭、山麻鸭和缙云麻鸭聚为一类；连城白鸭、莆田白鸭和莆田黑鸭聚为一类；三穗鸭和金定鸭聚为一类再与绍兴鸭、吉安红毛鸭、龙胜翠鸭、中山麻鸭、巢湖鸭聚为一大类；麻旺鸭单独聚为一类。

图4 系统发育进化树

2.2.3 群体结构分析群体结构是群体遗传分析的重要内容。本研究对300 个样本进行Admixture 检测分析。通过假设群体可以分成K=1～n 个亚群，图5 表示本研究假定的群体个数从2 到9。当K=2 时，莆田白鸭首先分离出来，K=4 时，连城白鸭分离出来，K=5 时，褐色菜鸭从15 个鸭遗传资源分离出来，K=6 时，中山麻鸭分离出来，K=7 时，吉安红毛鸭和龙胜翠鸭分离出来，K=8 时，巢湖鸭分离出来，K=9 时，有7 个群体能分离出来。

图5 群体结构图

3 讨论

3.1 15 个鸭遗传资源群体结构关系分析 PCA 的中心思想是“降维”，是由Hotelling[8]于1933 年首先提出的。通过PCA 发现，吉安红毛鸭、三穗鸭和绍兴鸭聚为一类，金定鸭、麻旺鸭、绍兴鸭、山麻鸭、攸县麻鸭聚为一类，莆田黑鸭和缙云麻鸭聚为一类，遗传距离较近，这与群体结构图的结果相似，通过系统发育树的结果发现麻旺鸭单独聚为一类，攸县麻鸭、山麻鸭和缙云麻鸭聚为一类；连城白鸭、莆田白鸭和莆田黑鸭聚为一类，这与张扬等[9]利用微卫星标记进行聚类的研究结果一致，这3个鸭遗传资源都是福建地方鸭资源，遗传距离较近；三穗鸭和金定鸭聚为一类；绍兴鸭、吉安红毛鸭、龙胜翠鸭、中山麻鸭、巢湖鸭聚为一大类，褐色菜鸭聚为一类，这与PCA 和群体结构分析有相似的地方，如褐色菜鸭在3 种方法中都是单独聚为一类的。

3.2 15 个鸭遗传资源的系统发生关系本研究通过邻近法构建系统发育进化树，来研究15 个鸭遗传资源的遗传距离。有研究表明，邻近结合法优于非加权组对算术平均法，它是最有效的基于距离数据重建系统发生树的方法之一[10]。系统发育进化树研究发现只有中山麻鸭其中一个个体与巢湖鸭聚为一类，其他13 个遗传资源均独立分布。中山麻鸭原产地为广东省中山县，而巢湖鸭原产地为安徽省庐江县，2 个品种的地理遗传距离相隔较远，但是聚为一类可能是它们历史上曾有过基因交流。攸县麻鸭先与山麻鸭聚为一类，然后和缙云麻鸭聚为一类；山麻鸭和缙云麻鸭都是福建地方鸭品种，地理距离较近，亲缘关系近，所以聚为一类，而攸县麻鸭和山麻鸭聚为一类，可能是它们都是蛋鸭品种，且历史上血缘关系较近；莆田白鸭和莆田黑鸭聚为一类，它们都是福建地方鸭遗传资源，且是同一个品种的两个品系；浙江省的蛋用型品种绍兴鸭、江西省的兼用型鸭品种吉安红毛鸭、广西龙胜的兼用型鸭品种龙胜翠鸭、广东省蛋用型鸭品种中山麻鸭和安徽省巢湖市的巢湖鸭聚为一类，但是除龙胜翠鸭和中山麻鸭距离较近，其他的鸭遗传资源均相隔较远，他们虽然聚为一大类，但品种间差异也较大，各具特色，具有重要的保种价值。褐色菜鸭单独聚为一类，它是台湾地方鸭品种，首先地理距离与其他鸭遗传资源相隔较远，然后因为两地隔海，可能没有发生过基因交流，所以单独聚为一类，也间接表明了国家级水禽基因库（福建）的保种效果较好，依然为纯种资源。