中国巴兹尔线虫属(线虫门：垫刃科)2个新记录种的鉴定

宁旭兰, 乔凯凯,2, 肖 顺, 石朝慧, 梁彩霞, 薛 清, 刘国坤

(1.福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福建 福州 350002;2.中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳 455000;3.南京农业大学植物保护学院，江苏 南京 210095)

垫刃科(Tylenchidae Örley, 1880)线虫是土壤线虫中一类种类多、数量大的复杂群体，土壤样本中该科线虫数量可超过线虫总数的30%，其在土壤生态系统或根系系统中均有重要的地位[1-2].目前,垫刃科有45个属，已描述种超过412个[3]，估计仍有75%～95%的垫刃科线虫种未被描述[4].巴兹尔属(BasiriaSiddiqi, 1959)是土壤中常见的垫刃科线虫属之一，目前已鉴定44个有效种[5].我国大陆地区共发现该属线虫7种：殷友琴[6]在广东省芒果树根系采集到喜草本巴兹尔线虫(B.graminophilaSiddiqi, 1959)；刘维志[7]在辽宁省马铃薯根系采集到尾粗巴兹尔线虫[B.tumida(Colbran, 1960) Geraert, 1968]；广东省苦瓜根系曾发生广东巴兹尔线虫新种[B.guangdongensisSyn. (RhabdotylenchusguangdongensisXie et al, 1994)][8-9]；滕文凤等[10]在江苏省卫矛、秤锤树、厚皮香苗圃地发现冬天巴兹尔线虫(B.hibernaBernard, 1980)；吴慧平等[11]在安徽省桔梗根系发现克什米尔巴兹尔线虫(B.kashmirensisJairajpuri, 1965)和B.pravamphidiaAndrassy, 1963；杨意伯[12]在福建省番石榴根系采集到里特巴兹尔线虫[B.ritteri(Baqri and Jairaipuri, 1969) Bernard, 1980].作者在福建省福州市芦苇根系和芒果树根系土壤中各采集到1种巴兹尔垫刃线虫，经形态学与分子生物学方法鉴定，分别为畸形巴兹尔线虫[B.aberrans(Thorne, 1949) Siddiqi, 1963]和纤细巴兹尔线虫[B.gracilis(Thorne, 1949) Siddiqi, 1963]，均为我国新记录种，现记述如下.

1 材料与方法

1.1 线虫的采集与分离

采集时间为2018年10月，采集地为福建省福州市连江县(26°12′13.02″N、119°33′07.28″E，海拔35 m)芦苇丛根系和福建农林大学(26°05′09.12″N、119°14′05.21″E，海拔14 m)芒果树根系.采集土层8～20 cm，采用浅盘法[13]分离线虫，用500目(孔径25 μm)网筛收集分离液.

1.2 形态鉴定

挑取线虫，用4%甲醛溶液固定，制成临时玻片标本，指甲油封边，在Nikon显微镜(Eclipse Ni-U 931609)下观察、拍照，并利用测量软件和De Man公式[14]测量和计算各形态指标.经4%甲醛溶液固定的线虫，经过甘油-乙醇脱水法[15]制成永久玻片标本保存.

1.3 分子生物学鉴定

1.3.1 DNA提取与PCR扩增及测序 采用蛋白酶K法提取线虫DNA.离心管中加入10 μL线虫裂解液WLB(50 mmol·L-1KCl、10 mmol·L-1Tris、2.5 mmol·L-1MgCl2、0.45% NP 40、4.5% Tween 20，pH=8.3)，将单条线虫挑入离心管中，用液氮冷冻1 min后取出，加入1 μL蛋白酶K(1.0 mg·mL-1)，再放入PCR仪中温育(65 ℃ 1 h，95 ℃ 10 min)[16].

PCR扩增：扩增核糖体RNA(rRNA)靶标基因18S区和28S D2-D3区.18S区全长用2对引物扩增[17]，分别为988F(CTCAAAGATTAAGCCATGC)/1912R(TTTACGGTCAGAACTAGGG)和1813F(CTGCGTGAGAGGTGAAAT)/2646R(GCTACCTTGTTACGACTTTT).28S D2-D3区用引物对D2A(ACAAGTACCGTGAGGGAAAGT)/D3B(TCGGAAGGAACCAGCTACTA)扩增[18].通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.采用25 μL扩增体系：7.5 μL ddH2O，12.5 μL Premix TaqTM(TAKARA，宝日医生物技术有限公司)，上、下游引物各1 μL，DNA模板3 μL.18S区扩增条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，重复40次；72 ℃延伸10 min.28S D2-D3区扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，重复35次；72 ℃延伸10 min.

扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序.用软件Geneious检验测序质量并进行序列的比对、拼接、头尾修饰，将目标序列提交至GenBank获取序列号.

1.3.2 系统进化树构建 运用CIPRES在线平台采用贝叶斯法(Bayesian inference, BI)和极大似然法(maximum likelihood, ML)构建系统进化树[19].用MAFFT比对方法中的Q-INS-I算法进行序列的多重比对[20]；选择MrBayes转换Nexus格式，选择RAxML转换Phylip格式；BI选择程序MrBayes on XSEDE(3.2.6)，采用GTR+I+G模型，运算5 000 000代，每运算100代对树形进行Markov chains采样，并剔除初始25%采样[21]；ML则选择RAxML-HPC2 on XSEDE程序[22]，采用GTRCAT模型，完成1 000次自展重复；最后采用软件Figtree v1.4.3[23]和Adobe Illustrator CC在贝叶斯50%多数原则一致树上标注自展值(BS)和后验概率(PP).

2 结果与分析

芦苇根系每百克土壤中的巴兹尔线虫数平均为13.2条；芒果树根系每百克土壤中的巴兹尔线虫数平均为16.8条.

2.1 形态特征

分离到的2个种群均符合垫刃科叉针亚科(Boleodorinae)巴兹尔属的识别特征：虫体线状，细小；头部高，侧器孔斜裂或V形，位于头部的侧面，明显；口针细小，基部球小，长度为7～14 μm，骨质化弱，针锥占口针长约1/3；食道前体部较细，中食道球弱至中等发达，具瓣，体前端至中食道球中间的长度占食道总长的34%～60%，后食道球短，梨形，与肠平接；侧区侧线有2、4或6条；雌虫单生殖管；尾细长，末端丝状、圆锥或钝圆状.

2.1.1 芦苇线虫种群的形态描述 雌虫:虫体细小，经热处理固定后，虫体略向腹部弯曲，长636～746 μm；角质膜有明显环纹；口针弱，微弯曲，基部球小(图1A)；侧区有4条侧线(图1B)；中食道球椭圆形，瓣门骨质化弱，处于食道中靠后的位置；后食道球短，梨形，与肠平接(图1C)；单生殖管，储精囊内大多空，少数可见精子；尾部伸直，末端钝圆，部分呈棍棒状或圆形(图1D).具体形态测计值见表1.

雄虫:未发现.

A-D:畸形巴兹尔线虫的口针、侧线、体前部、尾部;E-H:纤细巴兹尔线虫的口针、侧线、体前部、尾部.标尺=10 μm.图1 2种巴兹尔线虫雌虫的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of female Basiria spp.

表1 芦苇线虫种群形态测计值1)Table 1 Morphometrics of female nematode population from reed rhizosphere

芦苇线虫种群的形态测计值均在畸形巴兹尔线虫原始描述种形态测计值[24]范围内.芦苇线虫种群与畸形巴兹尔线虫近似种B.graminophila[9]相比，前者口针略弯曲，口针基部球末端至背食道腺开口的距离(DGO)为7.89 μm，而后者口针直,DGO紧邻口针球基部；与B.khouzestanensis[5]相比，芦苇线虫种群体型大(636～746 μm vs 430～635 μm)，最大体宽数值大(16.0～20.9 μm vs 12.8～15.6 μm).因此将芦苇线虫种群初步鉴定为畸形巴兹尔线虫.

2.1.2 芒果树线虫种群的形态描述 雌虫:细小，经热处理固定后，虫体伸直或略微弯曲，体长564～675 μm；环纹明显；头部椭圆，略微缢缩；口针骨质化弱，针锥部为口针长的1/3左右(图1E)；侧区有2条明显侧线(图1F)；中食道球位于食道中后部，卵圆形，瓣门弱；后食道球梨形，与肠平接(图1G)；储精囊卵圆形，未见精子；尾部长，逐渐变细，尾端圆(图1H).具体形态测计值见表2.

表2 芒果树线虫种群形态测计值1)Table 2 Morphometrics of female nematode population from mango tree rhizosphere

雄虫:未发现.

芒果树线虫种群与纤细巴兹尔线虫原始描述种[24]比较，除了口针长度略微偏小(7.7～9.5 μm vs 9.0～12.5 μm)外，其他形态特征基本符合，而口针长度的差异可能是由生长环境不同导致的.芒果树线虫种群与纤细巴兹尔线虫近似种B.paragracilics[9]相比，前者口针基部球明显，而后者无基部球；芒果树线虫种群与B.pravamphidia和B.tritici[9]相比，前者尾部逐渐变细，尾端圆，而后两种线虫尾部细尖，且B.tritici阴门至肛门距离更短.因此将芒果树线虫种群初步鉴定为纤细巴兹尔线虫.

2.2 系统进化树分析

两个线虫种群的18S区经测序共获得5条序列，上传GenBank获得序列号：芦苇线虫种群序列号为MK639389、MK639390和MK639391，序列长度分别为1 726、1 735和1 729 bp；芒果树线虫种群序列号为MK639394和MK639395，序列长度分别为1 733和1 730 bp.下载GenBank中垫刃科线虫的29条18S序列，构建系统进化树(图2).经BLAST比对，芦苇线虫种群3条序列与伊朗发现的畸形巴兹尔线虫序列 (KJ869415)相似性均在99.77%以上；在系统进化树(图2)上，芦苇线虫种群与畸形巴兹尔线虫 (KJ869415)聚在一起，并且与喜草本巴兹尔线虫(KJ869317)处于同一分支(PP=0.99，BS=100).芒果树线虫种群的2条序列与美国发现的纤细巴兹尔线虫序列(EU130839)一致性为98.73%，与伊朗发现的纤细巴兹尔线虫序列(KJ869351)一致性为98.84%；系统进化树(图2)显示，芒果树线虫种群与纤细巴兹尔线虫聚在同一分支，且支持度较高(PP=0.99，BS=98).

两个种群的28S D2-D3区经测序共获得4条序列，上传GenBank得到序列号.芦苇线虫种群序列MK639371、MK639372的长度分别为648、645 bp，与伊朗发现的未定种Basiriasp.(JQ004998、JQ005000)的一致性最高，达99%，与Basiriasp.(MK644825)的一致性为98%；系统进化树(图3)表明，这5个序列形成一个完全支持的支系(PP=1,BS=100)，且与湖泽斯坦巴兹尔线虫(B.khouzestanensis)互为姊妹群.芒果树线虫种群序列MK639375、MK639376的长度分别为763、774 bp，与纤细巴兹尔线虫(DQ328717)、巴兹尔线虫未知种Basiriasp.(DQ077803)一致性最高，为93%；在系统进化树(图3)上，这4个序列共同处于支持度较高的一个分支中(PP=0.99，BS=98),且与喜草本巴兹尔线虫互为姊妹群.

粗体表示本研究获得的5个序列. 分支数值为贝叶斯法所得概率(PP)/极大似然法所得自展值(BS).图2 基于18S rRNA基因序列建立的系统进化树Fig.2 Phylogeny tree based on the 18S rRNA sequences

综合形态特征和分子系统进化树分析结果，分别将芦苇线虫种群和芒果树线虫种群确定为畸形巴兹尔线虫和纤细巴兹尔线虫.

3 讨论

本研究利用形态学与分子生物学方法，分别从福建省芦苇和芒果树土壤中鉴定出畸形巴兹尔线虫和纤细巴兹尔线虫2个中国新记录种.两种线虫的形态特征与喜草本巴兹尔线虫差异小，在系统进化树上的亲缘关系也接近.Eisvand et al[5]认为,喜草本巴兹尔线虫与13个巴兹尔线虫种的形态特征很接近(B.babhi、B.binaria、B.brevia、B.haki、B.imphalensis、B.kashmirensis、B.lathyrae、B.lauta、B.macrostriata、B.raskiensis、B.shahidi、B.simhai、B.tenuis)，这些种都可归为喜草本巴兹尔线虫组群(group).

粗体表示本研究获得的4个序列. 分支数值为贝叶斯法所得后验概率(PP)/极大似然法所得自展值(BS).图3 基于28S D2-D3区基因序列建立的系统进化树Fig.3 Phylogeny tree based on the D2-D3 domain of 28S rRNA sequences

垫刃科线虫种类多，进化复杂，基于已知的垫刃科线虫的18S、28S D2-D3、线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因(COⅠ)序列构建的系统进化树中，有的属、种存在解析度与支持率低的状况，因此尚未建立系统的垫刃科线虫进化构架[25].在现有的垫刃科线虫分类体系中，大多数属为并系(paraphyly)或多系(polyphyly)，仅有少数属为单系(monophyly)，如头垫刃线虫属(Cephalenchus)、野外垫刃线虫属(Aglenchus)和具脊垫刃线虫属(Coslenchus)等.前人基于已有的少量样本研究显示，巴兹尔属为单系[26].本研究通过18S和28S D2-D3序列分析表明巴兹尔属为多系，属内不同种分别分布于两个支持度较高的分支上，且其中混杂着新平滑垫刃属(Neopsilenchus)和圆盘波斯属(Discopersicus).剑尾垫刃属(Malenchus)和双刃斧线虫属(Labrys)均存在类似现象[16,27].目前，GenBank上巴兹尔属线虫的序列数量较少，且该属线虫的形态学信息也较为匮乏.因此，今后需要更多的研究充实其分子与形态信息，以进一步完善其分类系统.