转录组学分析低温胁迫对西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫基因表达的影响

刘一名, 徐新建, 周姝婧, 姚 丹, 李 寒, 朱晨煜, 李 想, 王茗琦, 周冰峰, 朱翔杰

(福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)，福建 福州 350002)

温度是影响昆虫的外部形态[1-2]、行为[3]、繁殖能力[4]、生理功能[5-6]、能量代谢[7]等的环境因子之一.作为典型的社会性昆虫，蜜蜂具有调节巢温的能力，蜂群可以通过群体行为将蜂群子区的中心温度严格维持在35 ℃,以使卵、虫、蛹正常发育[8-10].当温度偏离最适温度35 ℃时，蜜蜂会出现死亡率增大、发育历期延长、外部形态异常、记忆能力减弱等现象[11-15].可见，蜜蜂对温度比较敏感[16].

转录组学是从转录层面上研究机体在某一状态下的基因表达水平及转录调控规律[17]，是目前在昆虫中广泛应用的组学研究手段[18].研究表明，低温会诱导斜纹夜蛾(Spodopteralitura)能量代谢从碳水化合物代谢向脂质代谢转变，并且能降低游离氨基酸的水平[19].中华蜜蜂(Apisceranacerana)成蜂经低温胁迫后的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)在代谢通路上富集最多，且多数是与糖、氨基酸的生物合成和代谢相关的通路，如甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢、碳代谢、磷酸肌醇代谢、脂肪酸代谢等，同时在Wnt、Hippo、FoxO等与生长发育相关的信号通路上也有富集[20].西方蜜蜂(A.mellifera)预蛹受到低温胁迫后的DEGs也集中在代谢和生长发育通路上[21].

当蜜蜂幼虫发育到6日龄时，蜂群会将巢房用蜂蜡封闭，不再需要工蜂饲喂食物，所以该龄期幼虫是研究低温胁迫影响的理想虫态.本研究团队前期研究显示，与预蛹和蛹早期相比，蜜蜂6日龄幼虫对低温的敏感性降低，20 ℃低温胁迫48 h对其死亡率没有影响[11].Mucci et al[22]研究显示，西方蜜蜂幼虫受到低温胁迫时，抗氧化能力提高.因此，推测西方蜜蜂6日龄幼虫可能通过提高抗氧化能力调节自身响应低温的能力.但具体通过哪些通路上的关键基因表达变化提高抗氧化能力，以及蜜蜂幼虫的生长发育在转录组水平上会受到怎样的影响仍需进一步明确.本试验将西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫进行20 ℃低温处理，利用转录组测序技术分析受低温胁迫后的DEGs，为后续深入研究该虫响应低温胁迫的机制提供依据.

1 材料与方法

1.1 虫源

西方蜜蜂工蜂幼虫取自福建省福州市福建农林大学实验蜂场(N 26°5′，E 119°13′)4—6月的蜂群.蜂群群势12足框，蜂王产卵正常.将空脾分别置于3个产卵蜂群中限王产卵1 d，以获取足够多卵龄一致的卵，再将卵脾放入同一哺育群哺育幼虫，幼虫经哺育6 d后封盖.为保证样本发育一致性，取2 h内封盖的6日龄幼虫，分别在正常发育条件[(35±0.2) ℃，RH 75%, CK]和低温条件[(20±0.2) ℃，RH 75%, T]下培养4 h后，取样本立即用液氮冷冻，-80 ℃保存.从3个蜂群各取10头幼虫作为每组样本的3个生物学重复.

1.2 高通量测序及测序数据质控

利用Trizol法提取全虫总RNA后，委托广州基迪奥生物科技有限公司使用Illumina HiSeqTM 4000平台对样品进行建库和RNA-seq测序.下机数据使用fastp v0.18.0过滤后，去除含adapter、N比例大于10%、全部都是A碱基、质量值Q≤20的碱基占50%以上的reads，得到clean reads[23]，然后与西方蜜蜂的基因组Amel_HAv3.1(NCBI Assembly: GCF_003254395.2)进行比对.

1.3 样本相关性分析

比较CK组和T组3个生物学重复样品测序得到的基因之间的pearson相关系数，使用Omicshare生信云工具平台(http://www.omicshare.com/tools/)进行分析.

1.4 DEGs筛选及功能分析

DEGs的筛选使用DESeq2[24]软件，筛选条件为|log2(FC)|≥1且错误发现率(false discovery rate, FDR)≤0.05.其中，FC为差异倍数(fold change)，是T组与CK组之间3个生物学重复的平均FPKM值的比值.使用Omicshare生信云工具平台对DEGs进行GO(gene ontology)功能分类和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，P<0.05为显著富集GO功能注释和KEGG通路.

1.5 实时荧光定量PCR(qPCR)验证

挑选5个在KEGG通路或GO功能注释上富集的DEGs进行qPCR定量检测.引物使用NCBI Primer BLAST设计(表1).将上述测序所用的总RNA反转录得到cDNA，以此作为模板进行目的基因的扩增，qPCR反应体系参照PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix试剂盒(北京全式金生物科技有限公司)说明书.qPCR程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s(40个循环)；熔解曲线条件为95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 1 s.以Actin作为内参基因，利用2-ΔΔCt法[25]计算目的基因相对表达量，每个目的基因进行3次生物学重复和3次技术重复后取平均值，再进行log2(平均值)的转换后，与测序数据进行对比.

表1 西方蜜蜂5个DEGs的qPCR引物信息Table 1 qPCR primers for 5 selected DEGs in A.mellifera

2 结果与分析

2.1 测序数据质量分析

通过转录组测序得到CK组和T组的原始reads(单位长度150 bp)分别为87 593 339±6 594 537和106 975 591±5 116 984，过滤后得到高质量有效reads分别为87 434 485±6 586 202和106 799 168±5 107 747，高质量reads占比分别为99.82%±0.04%和99.84%±0.04%.各样本有效碱基数据量均大于11 Gb，CK组和T组各个样品两端的平均Q20、 Q30分别为97.42%、92.83%和92.40%、92.68%(表2)，表明测序数据质量较好，可用于后续分析.CK组和T组的3个生物学重复样本间的pearson相关系数均大于0.968 8，显示各组内样本极强相关，样本重复性好.

表2 碱基过滤前后质量统计1)Table 2 Base quality before and after filtration

2.2 DEGs筛选

经过筛选，CK组与T组之间共检测到98个响应低温胁迫的DEGs，其中87个上调表达，11个下调表达(图1).

FC(fold change)为基因表达差异倍数，FDR(false discovery rate)为错误发现率.图1 低温处理组与正常发育组6日龄幼虫的差异基因火山图Fig.1 Volcano map of DEGs in 6-day-old larva grew under low temperature stress and optimal temperature

2.3 DEGs的功能富集分析

2.3.1 GO功能分类 西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫响应低温胁迫的基因富集在21条二级GO功能注释上.其中，上调DEGs富集在21条注释上，下调DEGs富集在15条注释上(图2).

图2 低温胁迫后DEGs的GO功能分类Fig.2 GO functional classification of DEGs in response to low temperature stress

上调DEGs中，26个富集在生物过程，23个富集在分子功能，12个富集在细胞组分.上调DEGs富集数最多的前5条二级GO功能注释分别为细胞进程(19个)、结合(18个)、代谢进程(16个)、催化活性(14个)、单有机体进程(12个).显著富集的GO功能注释共有43条，其中，生物过程上的GO功能注释有38条，多数与级联反应、应激反应、激酶活性相关(图3).

富集因子指DEGs中位于该功能注释的基因数与所有基因中位于该功能注释的基因总数的比值.图3 低温胁迫后上调DEGs在生物过程中显著富集的GO功能注释Fig.3 GO enrichment analysis of up-regulated DEGs in response to low temperature stress

下调DEGs中，3个富集在生物过程，5个富集在分子功能，3个富集在细胞组分(图2).显著富集的GO功能注释有6条，其中4条属于生物过程.

2.3.2 KEGG富集分析 KEGG富集分析显示，西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫受低温胁迫后，上调DEGs富集在14条B级通路(图4)的25条KEGG通路上，其中，代谢相关通路富集的DEGs最多.代谢相关的KEGG通路有氨基酸代谢上的赖氨酸降解，碳水化合物代谢的磷酸肌醇代谢，辅酶因子和维生素代谢的核黄素代谢，萜类和聚酮肽代谢的萜类骨架生物合成、昆虫激素生物合成，核苷酸代谢的嘧啶代谢、嘌呤代谢.其中，萜类骨架生物合成、核黄素代谢显著富集(图5).除代谢相关通路外，富集在信号转导B级通路上的DEGs也较多(图4)，信号转导的KEGG通路有Hippo信号通路、Notch信号通路、磷脂酰肌醇信号系统.

纵坐标中彩色字体表示KEGG A级通路，黑色字体表示相应A级通路下的B级通路.图4 低温胁迫后DEGs的KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis for DEGs in response to low temperature stress

西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫受低温胁迫后，下调DEGs富集在3条B级通路(图4)的3条KEGG通路上，分别为代谢方面的代谢途径、甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢和信号转导方面的MAPK信号通路.其中，属于氨基酸代谢的甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢显著富集(图5).葡萄糖脱氢酶(GCDH, LOC551044)和葡萄糖氧化酶(GOD, LOC406081)同时富集在代谢途径和甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢上.

富集因子指DEGs中位于该通路的基因数与所有基因中位于该通路的基因总数的比值.图5 低温胁迫后DEGs显著富集的KEGG通路Fig.5 Significant enriched KEGG pathways of DEGs in response to low temperature stress

2.4 DEGs的qPCR验证

挑选IP3K、Ex、CYP18A1、GOD、GCDH5个DEGs进行qPCR检测，结果显示，与对照组相比，低温胁迫后基因表达差异显著，基因IP3K、Ex、CYP18A1均显著上调表达，基因GOD和GCDH均显著下调表达.这与转录组测序结果的基因表达变化趋势一致(图6).

图中qPCR数据为平均值±标准差.柱上星号代表处理组与对照组之间基因表达差异显著(非配对T检验)：*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001.图6 5个西方蜜蜂DEGs的qPCR检测结果Fig.6 qPCR verification of 5 selected DEGs in A.mellifera

3 讨论

3.1 西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫可能通过提高抗氧化能力应对低温胁迫

核黄素是黄素单核苷酸(flavin mononucleotide, FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)的组成部分和前体，其以FMN和FAD的形式在昆虫体内参与广泛的氧化还原反应[26]，对细胞功能、昆虫生长和发育至关重要[27].有研究显示，果蝇受到氧化损伤时，体内核黄素会通过提高超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性增强抗氧化能力，使果蝇寿命明显延长[28].本研究表明，核黄素代谢通路在受低温胁迫的西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫中显著富集，黄素腺嘌呤二核苷酸合酶(FADS)基因上调表达.这说明西方蜜蜂可能以此提高体内核黄素抗氧化能力，延长自身寿命.这与本团队前期研究的蜜蜂6日龄幼虫在所有虫态低温处理中寿命最长的结果[11]相吻合.GOD可将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢[29]；有研究显示，过氧化氢会抑制丝腺细胞的程序死亡[30].本研究中，西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫在受到低温胁迫后，GOD基因下调表达，可能会减少葡萄糖的氧化，增强幼虫抗氧化能力，且过氧化氢的减少可能会造成丝腺细胞程序性死亡，使幼虫吐丝受到影响.还有研究显示，幼虫代谢旺盛时，GOD活性相对较高[31-32].低温胁迫后GOD基因下调表达可能也是导致幼虫取食量下降的原因.

3.2 西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫还可能通过抑制细胞生长应对低温胁迫

膨化蛋白(Ex)是调控Hippo信号通路的关键蛋白.Hippo信号通路是广泛存在于多细胞生物中的信号通路[33]，其主要功能是抑制细胞增殖和促进细胞凋亡[34].在Hippo信号通路上游，Ex蛋白与Kibra和Mer蛋白结合构成KEM复合体，起到激活Hippo信号通路、抑制细胞生长的作用[35].本研究中，西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫在受到低温胁迫后，Ex基因显著上调表达，激活Hippo信号通路，可能会抑制幼虫的细胞增殖而使其发育变慢.Notch通路的功能是促进细胞的增殖和分化[36].Numb蛋白通过调控Notch delt样配体4(Dll4)在细胞内的位置和稳定性抑制Notch通路表达[37].西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫在受到低温胁迫后，富集在Notch通路上的Numb基因也显著上调表达，可能以此抑制Notch通路而使幼虫生长发育变慢.细胞色素P45018A1(CYP18A1)基因参与激素生物合成通路，编码一种具有26-羟化酶活性的细胞色素P450酶；26-羟化酶对于20-羟基蜕皮激素(20E)分解代谢具有重要作用，其能使20E分解为20-羟基蜕皮激素酸，使其不能与下游基因结合而调控蜕皮；CYP18A1基因缺失会导致果蝇幼虫期延长和蛹的死亡[38].西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫在受到低温胁迫后，CYP18A1基因上调表达，可能会使幼虫中20E的滴度少于正常发育的幼虫，影响幼虫蜕皮的过程.

细胞代谢与信号转导紧密相关：信号传递网络可以促进细胞的代谢活性[39]，代谢物也可以控制信号蛋白的活性[40].西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫通过代谢和信号转导的共同作用对低温做出响应.其响应低温胁迫的基因FADS、GOD、CYP18A1富集的通路分别参与辅酶及维生素代谢、氨基酸代谢、萜类和聚酮肽代谢；Ex、Numb分别富集的Hippo、Notch信号通路均属于信号转导.因此，西方蜜蜂工蜂6日龄幼虫对低温的抵抗能力是由多种代谢反应和信号转导途径共同调控的.后续可以从转录组学检测到的代谢与信号转导通路入手，研究二者在蜜蜂响应低温胁迫中的作用机制.