3所综合性医院分离的多重耐药铜绿假单胞菌外排泵MexAB-OprM的表达分析

冯金鑫，张瑞琴

(1.山西医科大学药学院，太原 030001；2.山西医科大学第二医院药学部，太原 030001)

铜绿假单胞菌(PA)对多种抗菌药物表现为固有或获得性耐药，在呼吸科和ICU感染率较高，免疫力低下患者易被感染[1]。近年来，由于临床诊疗手段的提高以及抗生素的不合理使用，使多重耐药PA的分离率增加[2]。研究表明，PA的耐药机制包括产生抗生素灭活酶或修饰酶[3]、外膜的渗透性降低及通道蛋白缺失[4]、形成生物膜及主动外排系统[5]等。主动外排泵在PA的耐药机制中起重要作用，在所报道的外排泵中，MexAB-OprM的作用尤为明显，其具有广泛的底物特异性，会造成PA对多种类型的抗生素天然耐药[6]。本课题组采用实时荧光定量PCR (RT-PCR)法检测临床分离多重耐药PA外排泵表达情况,探讨多重耐药与外排泵之间的关系，同时检测调控基因mexR、nalC和nalD，观察基因突变与表达之间的关系，以期为临床治疗提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1仪器 Cytation酶标仪(美国 Biotek公司)；DYY-7C型电泳仪(北京市六一仪器厂)；荧光定量PCR系统(美国Applied Biosystems公司)。

1.2试药 哥伦比亚血琼脂培养基(济南百博生物技术股份有限公司)；外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰(Sigma公司)；抗菌药物头孢他啶、头孢哌酮舒巴坦、氨曲南、亚胺培南、阿米卡星和环丙沙星，均购自中国食品药品检定研究院；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、柱式细菌总RNA抽提纯化试剂盒，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3菌株来源 收集2018年7月～2019年7月山西省太原市3所综合性医院分离的多重耐药PA 31株。菌株均经过基质辅助的激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)鉴定。质控菌株为ATCC27853，购自中华人民共和国卫生部临床检验中心。对照株野生型铜绿假单胞菌(PAO1)，购自南开大学生命科学学院分子微生物学与微生物工程实验室。

2 方法

2.1抗菌药物敏感性试验与最小抑菌浓度(MIC) 根据临床实验室标准化协会指南(CLSI2020)[7]，利用肉汤稀释法进行头孢他啶、头孢哌酮舒巴坦、亚胺培南、环丙沙星、阿米卡星和氨曲南的敏感性试验。对3种或3种以上的抗菌药物同时耐药定义为多重耐药。耐药指数用耐药的抗生素种类数与送检的抗生素种类数的比值表示。将PA ATCC27853作为抗菌药物敏感性试验的质控菌株。

2.2主动外排泵的表型筛选试验 根据临床实验室标准化协会指南(CLSI2020)，加外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺(PAβN，最终质量浓度为50 mg·L-1),再次利用肉汤稀释法测定每株菌对头孢他啶、头孢哌酮舒巴坦、亚胺培南、环丙沙星、阿米卡星和氨曲南的MIC。如果加上外排泵抑制剂后，MIC值降低，表明外排泵表型筛选为阳性[8]。

2.3膜融合蛋白基因mexA的mRNA表达水平测定 将PA接种于哥伦比亚血琼脂培养基，过夜培养，严格按照柱式细菌总RNA抽提纯化试剂盒说明书提取PA总RNA。用紫外分光光度计测定D260/280(RNA浓度)、D260/230(RNA浓度)，根据测定值计算mRNA浓度。按照反转录试剂盒将mRNA反转录成cDNA，反应条件设置为25 ℃ 5 min、55 ℃ 15 min、85 ℃ 5 min，处理后，放置于冰上[9]。荧光定量PCR仪检测mexA的mRNA表达水平，引物序列根据文献设计，见表1，由上海生工科技公司合成[10]。每株细菌的目的基因及内参基因均做3个复孔，取平均每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数(Ct)值，实验菌株目的基因mexA表达量是相对于PA ATCC27853目的基因mexA的表达量计算得出的(定义ATCC27853的目的基因mexA的表达量为1)，将mexA基因的表达量较对照株表达量≥2倍定义为高表达菌株[11]。反应条件设置为95 ℃ 3 min 预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，95 ℃ 15 s,共进行40个循环，采用2-△△Ct进行实验结果的计算，△△Ct=(Ct目的基因-Ct内参基因)实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。

2.4PCR扩增调控基因mexR、nalC和nalD及测序 将外排泵表型为高表达的7株PA接种于哥伦比亚血琼脂培养基，过夜培养，严格按照Ezup 柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取PA总DNA。反应体系为25 μL 2×San Taq PCR Mix，5 μL DNA模板，2 μL上下游引物，15 μL Sterilized dd H2O，引物序列见表1。反应条件为预变性94 ℃ 5 min,变性94 ℃ 40 s，退火50 ℃ 60 s，72 ℃延升 60 s，进行30个循环，最后72 ℃延升10 min[12]。PCR产物送上海生工科技公司纯化并测序，将测序结果与Genbank中PAO1序列进行比较。

表1 扩增产物mexA、mexR、nalC和nalD的引物序列

2.5统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学处理，计数资料以率表示，多重耐药指数与外排泵表达量相关性采用Pearson相关性分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1菌株临床信息 31株多重耐药的PA来自3所综合性教学医院，其中26株(83.9%)来源于男性，5株来源于女性。送检标本中，11株(35.5%)来源于痰液，4株(12.9%)来源于尿液，9株(29.0%)来源于分泌物，2株(6.5%)来源于导管尖端，5株(16.1%)来源于血液。送检标本中，来自烧伤科12株(38.7%)，重症医学科9株(29.0%)，神经外科3株(9.7%)，心血管内科7株(22.6%)。

3.2抗生素敏感性试验 临床收集的 31株PA均属于多重耐药菌，分离出的PA对环丙沙星完全耐药(100%)，对氨基糖苷类阿米卡星的耐药率较低(64.5%)，见表2。

表2 菌株对抗生素敏感性试验结果

3.3主动外排泵的表型筛选 加入外排泵抑制剂PAβN时，耐环丙沙星、头孢他啶、氨曲南、头孢哌酮舒巴坦、亚胺培南、阿米卡星的PA外排泵表型筛选阳性率分别为96.8%、44.8%、41.4%、41.4%、40.0%、10.0%。见表3。

表3 加外排泵抑制剂PAβ N菌株MIC变化情况

3.4多重耐药、外排泵表达和调控基因mexR、nalC、nalD突变分析 7株PA多重耐药指数范围为0.83～1.00(0.94±0.08)，其中4株属于完全耐药。以PAO1为对照菌，mexB相对表达量范围为1.56～10.03(2.29±0.60)，4株属于外排泵的高表达。多重耐药指数与外排泵表达量之间相关系数为0.225，且P<0.05,表明多重耐药与外排泵表达量之间具有相关性，扩增产物经测序并与Genbank中公布的序列比对，有7株PA发生基因突变，其中mexR突变有2株，nalC突变有7株，nalD突变有3株。见表4。

表4 耐药指数、外排泵表达量和调控基因mexR、nalC和nalD突变分析

4 讨论

PA是医院常见的条件致病菌，易在潮湿环境中生长，氧气湿化瓶、淋浴头等常会被PA污染，是造成院内感染暴发的主要原因。由于临床经验性用药以及抗菌药物的不合理使用，PA极易发生由敏感菌向耐药菌的迅速转变。因此，从细菌耐药性产生的机制进行分析，对指导临床合理应用抗菌药物具有十分重要的意义[13]。

本研究对来自3所综合性教学医院分离的31株多重耐药的PA进行外排泵MexAB-OprM基因分析。标本主要来源于烧伤科和重症医学科，这2个科室的患者有其自身的特点：重症医学科患者病情危重，侵入性治疗较多，且自身免疫力低下，抗生素应用较多，因而成为多重耐药PA的主要人群[14]；烧伤科患者大多由于皮肤黏膜大量损伤而失去屏障，易导致环境或皮肤表面的条件致病菌入血，住院时间长，普遍使用广谱抗菌药物，极易感染多重耐药菌，而多重耐药PA给临床治疗带来极大困难[15]。

多重耐药PA的耐药机制极为复杂，细胞膜通透性降低、钝化酶产生、外排泵产生、通过染色体变异及质粒转导获得耐药基因、生物膜的产生等[16]。本文针对外排泵的耐药机制进行研究，联合外排泵抑制剂PAβN进行外排泵的表型筛选试验，结果显示，耐环丙沙星PA外排泵表型筛选阳性率最高(96.8%)，提示环丙沙星的耐药机制以产外排泵为主，与Goli H R等[17]研究结果相似。研究表明，氨基糖苷类药物的耐药机制主要取决于氨基糖苷类药物修饰酶，它主要通过共价修饰的方式使氨基糖苷类药物与核糖体的结合减少，从而导致耐药。本研究发现，耐阿米卡星PA外排泵表型筛选阳性率最低(10.0%)，进一步证实外排泵产生在氨基糖苷类的耐药机制中发挥的作用较小[18]。

耐药指数表示菌株的耐药程度，0表示待测菌株对所测的抗生素全部敏感，1表示完全耐药。本研究对选择的7株耐药指数高且平均值为0.94的PA进行膜融合蛋白基因mexA的mRNA表达量分析，结果显示，其外排泵MexAB-OprM相对表达量均较高，且多重耐药指数和外排泵表达量的相关系数为0.225，表明多重耐药与外排泵表达量之间具有相关性。为了进一步研究MexAB-OprM高表达机制，对7株PA的mexR、nalC和nalD基因产物进行测序，2株发生mexR突变，7株发生nalC突变，3株发生nalD突变，且出现氨基酸的替换。结果显示，Pa12 mexR基因在377位由T突变成A,导致缬氨酸突变为谷氨酸，与Ziha-Zarifi I等[19]的研究结果一致；Pa12和Pa16在nalC基因212位由G突变为A，导致甘氨酸突变为谷氨酸，在625位A突变为C，导致丝氨酸突变为精氨酸，这种类型的突变与Pan Y P等[20]的研究结果一致；Pa6、Pa15、Pa23和Pa24在147位由G突变为A，导致天冬氨酸突变为天冬酰胺。氨基酸的替换会影响阻遏蛋白mexR、nalC和nalD的结构，使其不能与操纵子结合，从而导致主动外排泵的高表达，导致对多种抗菌药物耐药。

外排泵MexAB-OprM在多重耐药PA中起着重要作用，外排泵调控基因突变可导致MexAB-OprM表达增强，从而形成获得性耐药。因此，对本地区3所综合医院多重耐药PA进行监测，了解耐药菌株的特点，为临床医生合理选用抗菌药物提供科学依据。