基于UPLC-ESI-MSn技术解析清营汤提取物的化学成分

张淑玫，陈佳娜，程 赛，周艺吉，辛志明，陈玲凡，张 旗*

(1.福建医科大学药学院天然药物学系，福州 350122；2.福建省新药安全评价中心，福州 350122)

在抗击新型冠状病毒肺炎疫情中，中医药发挥了良好的作用。刘清泉等[1-2]研究发现，中药复方制剂能显著缩短其病程，减轻患者的临床症状，减少普通型病例向重型及危重型的转化，降低病死率。各地卫生主管部门以中医专家共识性的病因病机分析为依据，制定了一批中医诊疗方案，向3个阶段不同证型新型冠状病毒肺炎推荐了指导性处方。全国地级市及以上卫生管理部门发布了308 种中药处方。治疗期主要证型为内闭外脱、疫毒闭肺、寒湿郁肺及邪热壅肺，共涉及 187 味药材。清营汤是治疗新型冠状病毒肺炎的常用复方之一，服用后低热消失，纳食改善，精神转好，可明显改善肺部炎症[3]。

清营汤出自吴鞠通的《温病条辨》，为温病学的经典方剂[4]。该方由水牛角、玄参、地黄、麦冬、金银花、淡竹叶、黄连、连翘及丹参9味中药组成，治疗热在营分证[5]，可清营透气，用于治疗邪热初入营分、身热、时有谵语、心烦不得入眠、或斑疹隐隐、舌绛而干、脉象细数的病症，临床主治急性肺炎、病毒性脑炎、乙型脑炎、流行性脑脊髓膜炎、急性胰腺炎、过敏性紫癜、脓毒症、败血症、肠伤寒或其他热性病证属热入营卫者[6-7]。药理研究表明，清营汤具有解热、抗炎、免疫调节、抗氧化等作用，在一定程度上可改善血液流变、心肌损害[7]。

清营汤临床应用广泛，但其复方药效物质尚未阐明。因此本研究将建立清营汤提取物的超高效液相色谱法(UPLC)特征图谱，并通过超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法(UPLC-ESI-MSn)总离子流图，根据质谱裂解信息以及文献对比结果，分析清营汤提取物的化学成分。

1 仪器与试药

1.1仪器 DZTE 型电热套(北京市永光明医疗仪器有限公司)；BUCHI 型旋转蒸发器(瑞士步琦有限公司)；5810R型离心机(德国 Effendorf 公司)；AR124CN型电子天平(奥豪斯仪器有限公司)；Waters ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪(美国 Waters 公司)；0.22 μm微孔过滤膜(有机系，津腾公司)；静电场轨道阱组合式高分辨质谱仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)； Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(150 mm×3 mm，1.8 μm，美国Agilent公司)。

1.2试药 甲酸和乙酸为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇(色谱纯)，赛默飞世尔科技中国有限公司；乙腈(色谱纯)，德国默克公司；无水乙醇(分析纯)，北京化工厂；蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司；清营汤处方药材，购自北京同仁堂药店。

2 方法与结果

2.1特征图谱的建立

2.1.1清营汤提取物的制备 清营汤处方组成：水牛角30 g，生地黄15 g，玄参9 g，竹叶心3 g，麦冬9 g，丹参6 g，黄连5 g，金银花9 g，连翘6 g。药材加10倍量体积分数为70%的乙醇回流提取3次，每次1 h，滤过，合并滤液，减压浓缩，定容至250 mL，得到质量浓度为1.1 g·mL-1的清营汤提取液。

2.1.2色谱条件 色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×3 mm，1.8 μm)；流动相：1 mL·L-1甲酸-甲醇；流速：0.2 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；检测波长：254 nm。流动相A为 1 mL·L-1甲酸，流动相B为甲醇，洗脱梯度：0 min，3%B；5 min，6%B；7 min，7%B；20 min，15%B；60 min，17%B；63 min，23%B；80 min，24%B；90 min，30%B；105 min，34%B；125 min，34%B；135 min，40%B。

2.1.3方法学考察

2.1.3.1精密度实验 取清营汤药材，按照2.1.1项下方法制备供试品溶液，按照2.1.2项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。通过对记录的色谱图进行数据处理，计算得其相对保留时间RSD值小于3%，16个共有峰面积的RSD值≤3%，表明仪器精密度良好。

2.1.3.2重复性实验 取清营汤处方药材，按照2.1.1项下方法平行制备供试品溶液，按照2.1.2项下色谱条件进样，记录色谱图。通过对记录的色谱图进行数据处理，计算得其相对保留时间的RSD值小于3%，16个共有峰面积的RSD值≤3%，表明此方法重复性良好。

2.1.3.3稳定性实验 取清营汤处方药材，按照2.1.1项下方法平行制备供试品溶液，按照2.1.2项下色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、36、48 h进样，记录色谱图。通过对记录的色谱图进行数据处理，计算得其相对保留时间RSD值均小于3%，16个共有峰面积的RSD值≤3%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.1.4指纹图谱的建立 按照2.1.2项下色谱条件测定，选择体积分数为70%的乙醇回流提取所得的样品溶液，并将其平行制备10份后平行进样，结果见图1。通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算相似度，结果见表1。10个批次的样品相似度均大于0.900，说明不同批次的样品无显著差异。

图1 对照品(R)和10批清营汤提取物的特征图谱

表1 10批清营汤提取物的相似度评价结果

2.2利用UPLC-MS-MSn解析清营汤提取物的化学成分 质谱条件为电喷雾(ESI)离子源，采用正、负离子模式检测，毛细管温度为350 ℃，氮气流速为30 arb，辅助气流速为10 arb，喷雾电压为3 kV，毛细管电压为35 V，管透镜电压为110 V，样品先进行全扫描，分辨率设为30 000，扫描范围m/z为100～1 500，二级和三级质谱采用动态数据依赖性扫描，选取上一级丰度前10强的峰进行碰撞诱导解离 (CID) 碎片扫描，以离子阱进行检测。

根据UPLC-MS-MSn中总离子流图中峰的保留时间以及离子碎片，并结合参考文献，共解析出61个化合物[8-20]，包括黄酮类、环烯醚萜类、苯丙素类、生物碱类、有机酸类和三萜皂苷类等化合物。见表2和图2。

图2 清营汤提取物的总离子流图

3 讨论

本研究通过考察清营汤在不同检测波长、不同质量浓度、不同提取溶剂、不同流动相条件下的色谱图，得到清营汤提取物UPLC的最佳洗脱条件，建立清营汤的最佳色谱图。同时运用高效液相色谱-质谱联用技术得到UPLC-ESI-MSn总离子流图，并根据其质谱的裂解碎片信息及文献信息推断出清营汤的主要化学成分，其主要含有地黄苷(地黄苷A、地黄苷D、地黄苷C、地黄苦苷、洋地黄叶苷 C、焦地黄苷A1/A2等)、绿原酸(异绿原酸C、异绿原酸B、新绿原酸、隐绿原酸等)和连翘酯苷E等类别，共61个化合物。其中通过查询文献得知，连翘酯苷E、二氢梓醇、腺苷、单蜜力特苷、蜜力特苷、8-表番木鳖酸、毛蕊花糖苷、连翘酯苷和地黄苷类等来源于麻杏石甘汤中的地黄；6-O-甲基梓醇、哈巴俄苷、ningpogoside A、cistanoside F、6-O-methylaucubin和cistanoside D等来源于玄参；连翘酯苷A、芦丁和槲皮素来源于连翘；木兰花碱、非防己碱、表小檗碱、药根碱、黄连碱、巴马亭和小檗碱等来源于黄连；马钱子苷、柠檬酸、奎宁酸、马钱子酸和绿原酸类来源于金银花；methylophiopogonanone A、lirigramoside A、ophiopojaponin A、(+)-pinoresinol-β-D-glucoside和(+)-epipinoresinol-4′-O-glucoside等来源于麦冬；其余各成分归属于其余药材。本研究阐明了清营汤的基本化学成分，为开发治疗新型冠状病毒肺炎药物提供了理论依据，为进一步指导清营汤的临床应用奠定了基础。