基于分子对接技术探索京制牛黄解毒片治疗新型冠状病毒肺炎的机制

戴子琦，李木子，高 丰，肖婷婷，吴倩文，侯新娟，陈可点，顾昱昊，崔鹤蓉，杜 菁*，徐 冰*，雷海民*

(1.北京中医药大学，北京 100102；2.北京同仁堂科技发展股份有限公司，北京 100062)

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)具有潜伏期长、传染性强和各类人员普遍易感的特点，对全球人民的健康、经济的发展和社会的稳定带来了巨大影响[1]。在临床上，清肺排毒汤和化湿败毒方等中药复方及安宫牛黄丸和连花清瘟胶囊等中成药均被证实具有较好的疗效。

京制牛黄解毒片是北京同仁堂科技发展股份有限公司生产的治疗火热内盛证的国家二级中药保护品种[2]，由黄连、黄柏、石膏、金银花、薄荷、桔梗、连翘、大黄、黄芩、栀子、菊花、荆芥穗、防风、旋覆花、白芷、川芎、蔓荆子、蚕沙、甘草、人工牛黄和冰片组成，具有清热解毒、散风止痛的功效，主治肺胃蕴热引起的头目眩晕、口鼻生疮、风火牙痛、暴发火眼、咽喉疼痛和耳鸣肿痛。

本研究拟通过网络药理学方法确定核心靶标，并对其进行功能富集，以期在分子层面上阐释京制牛黄解毒片多成分、多靶点和多途径发挥清热解毒、散风止痛功效的科学内涵，为其治疗COVID-19的临床应用提供参考，同时为其进一步的作用机制研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1京制牛黄解毒片中活性化合物筛选及作用靶点的确定 本研究运用中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索京制牛黄解毒片中所含20味药材的化学成分，根据收集到的相关信息按口服利用度(OB)和类药性(DL)为指标进一步遴选各药味中的化学成分，符合DL≥0.18且OB≥30%的化学成分作为活性成分，并得到相关的作用靶点信息。为了避免个别认可度高的有效成分被筛选掉，因此查阅《中国药典》2020年版，得到此类成分合并至筛选结果中。将得到的靶标蛋白借助Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)查询对应的基因名。

1.2COVID-19靶点的收集及潜在靶点预测 在Gene Cards数据库(https://www.genecards.org/)以“novel coronavirus pneumonia”作为关键词进行检索，得到COVID-19相关的作用靶点，与所得活性化合物对应的靶点取交集，以得到京制牛黄解毒片治疗COVID-19的潜在作用靶点。

1.3蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络、“药材-化合物-作用靶点-疾病” 网络的构建 将得到的京制牛黄解毒片治疗COVID-19的潜在作用靶点导入String平台(https://string-db.org/)，去除孤立靶点，以置信度(0.400)为条件筛选，得到潜在靶点的相互作用关系。分析结果保存为tsv格式，将此数据导入到Cytoscape 3.7.2软件中，结合度值进行PPI网络的构建。并利用Cytoscape 3.7.2软件完成 “药材-化合物-作用靶点-疾病”网络的构建[3]。

1.4靶点通路富集分析 为进一步了解作用靶标的生物学功能，将关键靶点导入到DAVID网站中(https://david.ncifcrf.gov/)对其进行基因本体论(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析。在DAVID的基因列表通用管理面板中复制黏贴基因列表，Select Identifier选择“OFFICIAL GENE SYMBOL”，List Type设置为“Gene List”，提交且选择相对应的物种“Homo Sapiens”，得到结果并对其进行可视化处理。

1.5分子对接研究 SARS-CoV-2的宿主细胞受体是血管紧张素转化酶Ⅱ(ACE2)，且SARS-CoV-2是通过其棘突S蛋白与人体细胞表面的ACE2 受体结合，从而造成病毒侵入人体内而导致COVID-19。本研究选取“药材-化合物-作用靶点-疾病”网络中综合排名前10的关键成分以及COVID-19关键靶点SARS-CoV-2 3CL水解酶(Mpro)、ACE2进行分子对接。由RCSB PDB 数据库(https://www.rcsb.org/)中获得Mpro(PDB ID：6LU7)和ACE2(PDB ID：1r42)的三维结构，导入AutoDock 4.2.6进行除水，加氢，分别保存为PDBQT格式。从Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载化合物结构sdf文件，采用Chem3D软件将其转化为mol2文件，再将其导入AutoDock 4.2.6中，保存为PDBQT格式。最后，运用AutoDock 4.2.6对其进行分子对接，本研究以亲和能≤-5.0 kcal·mol-1作为筛选标准[4]。

2 结果

2.1活性化合物的筛选结果 经过TCMSP数据库检索后，京制牛黄解毒片20味药材(生石膏除外)筛选出的活性化合物共420个(OB≥30%，DL≥0.18，查阅《中国药典》的成分包含，无靶点蛋白的化合物删除)。其中黄连、黄柏、金银花、薄荷、桔梗、连翘、大黄、黄芩、栀子、菊花、荆芥穗、防风、旋覆花、白芷、川芎、蔓荆子、蚕沙、甘草、牛黄、冰片分别为14、38、24、11、7、23、19、37、16、23、9、19、19、22、8、28、3、92、5、3个。

2.2京制牛黄解毒片治疗COVID-19的潜在作用靶点 通过Gene Cards数据库共收集到259个与COVID-19相关的靶点，与京制牛黄解毒片的334个靶点进行交集分析后得到60个共有靶点，见图1。

图1 京制牛黄解毒片治疗COVID-19靶点的韦恩图

2.3京制牛黄解毒片治疗COVID-19潜在靶点PPI网络构建 利用STRING网站对潜在作用靶点进行分析，将输出结果Tsv文件导入Cytoscape 3.7.2软件，构建出PPI网络图，见图2。由图2可知，包含60个节点和870条边。图中节点是指蛋白，节点越大，颜色越深，表明等级值越大，每条边表示蛋白与蛋白之间的相互作用[5]。靶蛋白的平均节点等级值为29，超过平均节点等级值的有33个。筛选出前5个节点度值的靶点蛋白，分别是白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)和丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)，表明这5个核心靶点在网络中的关键作用。研究表明，重症COVID-19患者的IL-6和白细胞介素-10(IL-10)水平均较轻症患者高[6]，在一定程度上支持了该网络图。

图2 京制牛黄解毒片与COVID-19交集靶点的PPI网络

2.4“药材-化合物-作用靶点-疾病”网络的构建 运用Cytoscape 3.7.2软件构建“药材-化合物-作用靶点-疾病”网络图，见图3。由图3可知，紫色三角形表示各味药材，浅蓝椭圆形表示活性化合物，绿色方形表示潜在作用靶点，红色菱形表示疾病，共包括305个节点(19个药材节点、225个化合物节点、60个靶点节点、1个表示COVID-19的节点)和1 362条边。度值反映网络中节点与其他节点连接的数量，中心度值是网络中所有最短路径中经过该节点路径的数量与最短路径总数之比，度值与中心度值是2个主要拓扑参数，用来衡量1个节点在网络中的重要性。本研究根据度值和中心度值筛选大于等于所有点中位数2倍的节点，并满足接近中心度值大于所有点中位数值的节点作为网络中的关键节点，探讨京制牛黄解毒片的潜在物质基础。通过分析筛选到的关键化合物有15个，关键靶点有17个。其中排名前5位的化合物是槲皮素、木犀草素、山柰酚、汉黄芩素和β-谷甾醇；排名前5的靶点是前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)、前列腺素G/H合成酶1(PTGS1)、诱导型一氧化氮合酶 (NOS2)、二肽基肽酶Ⅳ(DPP4)和凝血因子Ⅹa(F10)，见表1和表2。由图3可知，1个活性化合物可对多个靶点起作用，与此同时也存在多个成分对1个靶点起作用，体现了京制牛黄解毒片多成分和多靶点相互协同治疗COVID-19的特点。

表1 京制牛黄解毒片的主要活性化合物(排名前10)

表2 京制牛黄解毒片的主要靶点

图3 “药材-化合物-作用靶点-疾病”网络

2.5GO富集分析及KEGG通路分析结果 通过DAVID网站中的GO富集分析得到了GO条目(P<0.05)，其中包含100个生物过程(BP)条目，前15条目见图4。

图4 GO (BP)功能分析

在BP中靶点主要涉及细胞对缺氧的反应、细胞对内毒素的反应、药物应答和炎症反应。KEGG通路富集分析筛选得到52条(P<0.05)，主要涉及细胞凋亡、TNF信号通路、乙型肝炎、HIF-1信号通路和鞘脂信号通路等，其中细胞凋亡通路涉及的靶点有磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基γ亚型(PIK3CG)、半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)、肿瘤坏死因子(TNF)、转录因子p65(RELA)、凋亡调节剂(BAX)、凋亡调节因子(BCL2)和细胞肿瘤抗原p53(TP53)；TNF信号通路涉及的靶点有PIK3CG、细胞间黏附因子1(ICAM1)、CASP3、TNF、PTGS2、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)和RELA；乙型肝炎通路涉及的靶点有PIK3CG、CASP3、TNF、RELA、BAX、BCL2和TP53；HIF-1信号通路涉及的靶点有PIK3CG、RELA、血红素加氧酶1(HMOX1)、BCL2、内皮一氧化氮合酶(NOS3)和(NOS2)；鞘脂信号通路涉及的靶点有PIK3CG、TNF、MAPK14、RELA、BAX、BCL2、TP53和NOS3。选取P值较小的前20条通路进行可视化，结果见图5。

图5 京制牛黄解毒片作用靶点KEGG富集通路分析的20条通路

2.6京制牛黄解毒片核心化合物作用于SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2的分子对接 一般认为配体与受体结合的构象稳定时，能量越低，发生作用的可能性越大。分子对接结果显示，将京制牛黄解毒片在“药材-化合物-作用靶点-疾病”网络中的度值及中心度值综合排名前10的活性化合物及5种临床治疗药物与SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2分别进行分子对接，结果见表3。由表3可知，这些化合物与2个酶之间的亲和能均低于-5.0 kcal·mol-1，表明京制牛黄解毒片中的核心化合物与这2个酶均有较好的结合活性。其中，化合物β-谷甾醇、大黄素、山柰酚、木犀草素、柚皮素与SARS-CoV-2 3CL水解酶亲和能较低，且它们与ACE2的亲和能均低于-7.0 kcal·mol-1。这5个化合物与5种目前临床治疗药物比较，亲和能未见显著差异。由此可知，这些核心化合物与受体蛋白形成构象能量低，结构稳定，结合活性较高。部分化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2的分子对接图见图6和图7。

表3 京制牛黄解毒片核心化合物及临床治疗药物与SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2的结合亲和能

图6 与SARS-CoV-2 3CL水解酶的分子对接

图7 与ACE2的分子对接

3 讨论

本研究运用网络药理学方法和技术共筛选出京制牛黄解毒片中活性成分420个，作用靶点334个，进一步得到关键化合物15个，关键靶点17个，体现了京制牛黄解毒片多成分、多靶点联合作用的整体性和关联性的特点。根据构建的“药材-化合物-作用靶点-疾病”网络的拓扑属性分析结果可知，京制牛黄解毒片主要活性成分和综合评分最高的前10个化学成分中有8个属于黄酮类化合物，排名前5的关键化合物是槲皮素、木犀草素、山柰酚、汉黄芩素和β-谷甾醇。现代药理研究发现，槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用[7]。有研究发现，槲皮素可降低感染小鼠死亡率和肺指数，抑制病毒的复制，减轻肺部的炎症，对流感病毒感染小鼠有治疗作用[8]；槲皮素可明显减轻肺结核病造成的肺脏炎症反应，推测其机制为槲皮素抑制Toll受体4(TLR4)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的高表达，阻碍相关炎症信号通路激活从而减少相关炎症因子的释放，抑制炎症反应，减轻组织病理损伤，起免疫调节抗感染作用[9]；此外槲皮素通过抑制鞘氨醇激酶1/鞘氨醇-1-磷酸(SphK1/S1P)信号在体内外均可改善肺纤维化[10]。木犀草素可以抑制白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、IL-6、白细胞介素-8(IL-8)、IL-10、白细胞介素-13(IL-13)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、β干扰素(IFN-β)，并提高IL-10的水平。另外，木犀草素还能够抑制免疫细胞迁移和定位的趋化因子，如趋化因子2(CCL2)、CXC类趋化因子2(CXCL2)、CXC类趋化因子8(CXCL8)和CXC类趋化因子9(CXCL9)等[11]。山柰酚可调节信号传导与转录激活因子3(STAT3)和核因子κB(NF-κB)信号通路的激活，以减弱IL-6对环氧化酶-2(COX-2)或PTGS2表达的影响，其对调节急性和慢性炎症起关键作用[12]。β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、免疫调节等药理作用[13]。

根据PPI网络分析结果，其中度值排名靠前的靶点有IL-6、TNF、MAPK3、MAPK8和MAPK1等。IL-6是免疫系统对损伤和感染最初反应所表达的重要细胞因子，在早期激活Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)信号通路，启动调节B细胞分化、浆细胞生成以及一系列急性期反应，在急性炎症反应中处于核心地位[14]。阻断IL-6与其受体的结合可以抑制炎性风暴，从而具有治疗炎症的作用[15]。SARS-CoV-2感染的重症患者血浆、肺泡灌洗液以及外周血单核细胞内白细胞介素2(IL-2)、IL-6、IL-7、IL-10、TNF-α、CCL2、趋化因子3(CCL3)、趋化因子4(CCL4)和CXC类趋化因子10(CXCL10)的表达水平明显升高[16-17]。此外研究表明，在氧化应激、DNA损伤、癌症和病毒感染的环境应激下丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员MAPK3、MAPK8、MAPK1和MAPK14被激活[18]。

GO功能富集分析得到BP条目100个(P<0.05)，KEGG通路富集分析筛选得到52条(P<0.05)信号通路，GO功能富集分析结果发现，京制牛黄解毒片活性成分主要涉及细胞对缺氧的反应、凋亡过程、炎症反应、调节参与炎症反应的细胞因子的产生等生物学过程；KEGG通路富集分析显示，在靶点富集的前20条通路中，7条通路与病毒感染相关，包括乙型肝炎、结核病、百日咳和丙型肝炎等。这预示着京制牛黄解毒片在抗病毒中具有重要作用，可能是其治疗COVID-19的原因。KEGG主要涉及癌症通路、细胞凋亡、鞘脂信号通路、TNF信号通路、乙型肝炎和HIF-1信号通路，以上通路除癌症通路均涉及基因TNF，且TNF在PPI网络图中也处在核心位置。TNF是由活化单核巨噬细胞、T淋巴细胞等生成及分泌的一种强有力的致炎症因子，TNF-α与2型TNF受体(TNFR2)结合后可通过经典和非经典方法激活NF-κB信号转导通路，诱导血管内皮细胞产生更多的炎症介质，如IL-6、IL-8、白细胞介素-1(IL-1)以及前列腺素(PG)等[19]。此外，缺氧诱导因子-1(HIF-1)由缺氧诱导因子-1α(HIP-1α)和缺氧诱导因子-1β(HIF-1β)2种亚基构成，是缺氧应激的关键因子，是氧稳态的主要调节剂。HIF-1通路与病毒性肺炎的炎症因子释放有关[20]，且HIP-1α表达的上调可导致肺部阻塞性疾病的发展[21]。MAPK通路与病毒性肺炎有关[22]，表皮生长因子受体(EGFR)磷酸化后，激活MAPK信号通路，诱导气道上皮细胞黏蛋白MUC5AC合成表达上调，促进杯状细胞增生，增加黏液分泌，导致气道阻塞[23]。

ACE2和新冠病毒的棘突S蛋白高效结合，通过识别ACE2蛋白进入人体细胞。新冠病毒复制所必须的酶是3CL水解酶，抑制3CL水解酶能够有效抑制病毒的感染与复制。分子对接结果显示，京制牛黄解毒片中的核心化合物与SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2的亲和能均小于-5.0 kcal·mol-1，并与5种目前临床使用的阿比多尔、利托那韦、洛匹那韦等药物的亲和能接近，由此可见，这些核心化合物与受体蛋白结合活性较高。推测京制牛黄解毒片中的核心化合物可能通过与ACE2的结合来阻止病毒侵入机体，通过与3CL水解酶的结合控制对病毒的复制，但具体作用机制还有待深入研究。

目前，已有学者采用网络药理学方法对中药方剂抗COVID-19的活性成分进行预测。通过总结现有报道发现，虽然金花清感颗粒、清肺排毒汤、麻杏石甘汤[24-26]等一线临床用药在药味组成上具有差异，而对其所预测筛选得到的抗COVID-19核心化合物中大多存在槲皮素、木犀草素、山柰酚和汉黄芩素等黄酮类化合物。结合本文研究结果，同样证实了槲皮素、木犀草素和山柰酚等黄酮类化合物可能对COVID-19具有药效作用。综上所述，京制牛黄解毒片全方具有清热解毒、散风止痛的功效，方中主要通过槲皮素、木犀草素和山柰酚等黄酮类化合物以及β-谷甾醇等植物甾醇类化合物，调节与病毒感染、细胞凋亡和免疫炎症相关的PTGS2、NOS2、PIK3CG、CASP3、BCL2、RELA、BAX和TNF等关键靶标，这些靶点共同参与调节细胞凋亡、TNF、鞘脂和HIF-1等信号细胞凋亡、通路发挥调节免疫炎症反应、抗病毒感染和改善肺纤维化的作用，从而具有治疗COVID-19的作用。鉴于网络药理学的局限性，后期还需对京制牛黄解毒片的活性成分、作用靶点及信号通路进行进一步实验验证。